使用荧光激活的细胞核分选从新鲜冷冻的皮质中分离出成年人类星形胶质细胞群

该协议可以帮助有兴趣研究人类星形胶质细胞在其天然生态位中的分子功能的科学家。该技术的主要优点是，它允许使用荧光活化细胞核分选从大量人脑组织标本中分离和富集特定细胞类型，成体星形胶质细胞。该方法可用于使用其他适当的荧光偶联抗体从人新皮层中分离其他细胞类型，例如神经元和少突胶质细胞祖细胞。

开始从新鲜冷冻的人体皮层组织样本中解剖约200至400毫克的组织。将组织置于含有四毫升冰冷裂解缓冲液的七毫升玻璃组织解液中，并将组织研磨约50次。将匀浆转移到12毫升超速离心机聚丙烯管中。

使用5毫升移液管将6.5毫升冰冷的蔗糖缓冲液加入超速离心管的底部，而不会干扰蔗糖和组织匀浆之间的界面。为了收集细胞核，将裂解物以101，814倍G超速离心一小时，并小心地吸出上清液和碎屑而不会干扰沉淀。在PBS中加入0.1%BSA到超速离心管中，在冰上孵育10分钟，然后重悬核沉淀。

然后，使用台盼蓝在光学显微镜下观察完整的细胞核，并确保浓度高于每毫升10至第五个细胞核对于分离的细胞核的荧光活化分选，将约20微升重悬的样品加入含有Alexa fluor 555偶联小鼠抗NeuN抗体的抗体溶液中。将约20微升重悬的样品加入含有APC偶联小鼠抗PAX6抗体的抗体溶液中。在四摄氏度下振荡孵育一小时后，避光，以1:1000的比例向所有样品和对照添加DAPI。

为了包括适当大小的细胞核并排除红细胞和碎片，请使用对照管通过其前向和侧面散射区域来门控细胞。要选择单线态核群，请按前向散射面积与前向散射宽度或高度以及侧向散射面积与侧散射宽度或高度进行门。通过DAPI进行门，仅包括完整的核单线态，并排除任何碎片和双线体。

根据任何其他荧光对照进行门控后，运行仅DAPI对照样品。运行仅限 NeuN Alexa 荧光 555 的对照，以确定 Alexa Fluor 555 通道中 NeuN 阳性染色的截止值。运行仅限 PAX6 的 APC 控制，以确定 APC 通道中 PAX6 阳性染色的截止值。

运行完所有对照组后，对 NeuN 阳性细胞进行门控以收集神经元，并将 PAX6 阳性细胞与 NeuN 阴性群体进行门控以收集星形胶质细胞。从 NeuN 阴性 PAX6 阴性人群中取出并收集任何额外的感兴趣的神经胶质细胞群。对于大宗单核RNA测序，在0.04%BSA补充的PBS中收集50， 000至500， 000个细胞核后，向样品中加入2毫升蔗糖溶液，50微升一摩尔氯化钙和30微升单摩尔乙酸镁。

使用PBS将悬浮液的最终体积增加到10毫升。通过倒置混合管内容物，并将反应物在冰上孵育15分钟。通过离心沉淀细胞核，并将细胞核重悬于一毫升RNA提取试剂中。

然后，涡旋管，将样品冷冻在干冰上，并将细胞核储存在零下80摄氏度。对于体单核转座酶可接受的染色质测序，将50， 000至75， 000个细胞核收集到0.04%BSA补充的PBS中，在涂有5%BSA的微量离心管中，并冷冻细胞核直到其下游分析。神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞祖细胞核细胞群可以从新鲜冷冻的死后人颞新皮层样本中分选，如图所示。

单核RNA测序研究进一步优先考虑PAX6作为原生质和纤维状成星胶质细胞亚群中顶级差异表达的核转录因子。分选后，可以表征原发性病理性癫痫新皮层中的细胞类型特异性转录组改变。在该分析中，转录组学分析证实，PAX6阳性NeuN阴性群体在全星形胶质细胞标志物方面被强烈富集，在神经元标志物中耗尽。

免疫荧光染色可用于确认 PAX6 与神经胶质纤维酸性蛋白在人皮质星形胶质细胞中的共定位。较短的死后间隔与新鲜组织样本中完整的细胞核恢复率更高有关。高产量的完整细胞核可以在死后24小时内从冷冻组织中恢复，但在30小时时，很少有完整的细胞核可以恢复。

要记住的最重要的事情是从NeuN阴性人群中获取PAX6阳性人群，因为有些神经元也表达PAX6，我们希望排除这些神经元。该技术还允许研究癫痫手术脑标本中的星形胶质细胞，进一步阐明了在特定病理生态位背景下人类星形胶质细胞的分子失调。