Questo protocollo può aiutare gli scienziati che sono interessati a studiare la funzione molecolare degli astrociti umani nella loro nicchia nativa. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'isolamento e l'arricchimento di un tipo di cellula specifica, astrociti adulti da campioni di tessuto cerebrale umano alla rinfusa utilizzando la selezione dei nuclei attivati dalla fluorescenza. Questa metodologia può essere applicata per isolare altri tipi di cellule dalla neocorteccia umana, come i neuroni e le cellule progenitrici degli oligodendrociti utilizzando altri anticorpi coniugati fluorescenti appropriati.
Iniziare a sezionare circa 200-400 milligrammi di tessuto da un campione di tessuto della corteccia umana adulta fresco congelato. Posizionare il tessuto in un douncer di tessuto di vetro da sette millilitri contenente quattro millilitri di tampone di lisi ghiacciato sul ghiaccio e macinare il tessuto circa 50 volte. Trasferire l'omogeneizzato in un tubo di polipropilene ultracentrifuga da 12 millilitri.
Utilizzare una pipetta da cinque millilitri per aggiungere 6,5 millilitri di tampone di saccarosio ghiacciato sul fondo del tubo ultracentrifugato senza disturbare l'interfaccia tra il saccarosio e l'omogeneizzato tissutale. Per raccogliere i nuclei, ultracentrifugare il lisato per un'ora a 101, 814 volte G e aspirare accuratamente il surnatante e i detriti senza disturbare il pellet. Aggiungere lo 0,1% di BSA in PBS al tubo ultracentrifuga per un'incubazione di 10 minuti sul ghiaccio prima di risospendere il pellet di nuclei.
Quindi, utilizzare il tripano blu per visualizzare i nuclei intatti al microscopio ottico e per assicurarsi che la concentrazione sia superiore a 10-quinto nucleo per millilitro Per lo smistamento attivato dalla fluorescenza dei nuclei isolati, aggiungere circa 20 microlitri del campione risospeso a una soluzione anticorpale contenente l'anticorpo anti-NeuN del topo coniugato Alexa fluor 555. Aggiungere circa 20 microlitri del campione risospeso a una soluzione anticorpale contenente anticorpi anti-PAX6 di topo coniugati apc. Dopo un'incubazione di un'ora a quattro gradi Celsius con agitazione, al riparo dalla luce, aggiungere DAPI con un rapporto 1:1000 a tutti i campioni e controlli.
Per includere nuclei delle dimensioni appropriate ed escludere globuli rossi e detriti, utilizzare un tubo di controllo per bloccare le cellule dalle loro aree di dispersione anteriore e laterale. Per selezionare la popolazione di nuclei singoletti, gate per area di dispersione in avanti rispetto alla larghezza o altezza di dispersione in avanti e area di dispersione laterale rispetto alla larghezza o altezza di dispersione laterale. Gate by DAPI per includere solo le singolette dei nuclei intatti ed escludere eventuali detriti e doppietti.
Dopo aver gating in base a eventuali controlli di fluorescenza aggiuntivi, eseguire il campione di controllo solo DAPI. Esegui il controllo NeuN Alexa fluor 555-only per determinare il cutoff per la colorazione NeuN-positiva nel canale Alexa fluor 555. Eseguire il controllo PAX6 solo APC per determinare il cutoff per la colorazione PAX6-positiva nel canale APC.
Dopo che tutti i controlli sono stati eseguiti, gate le cellule NeuN-positive per raccogliere i neuroni e gate le cellule PAX6-positive con la popolazione NeuN-negativo per raccogliere gli astrociti. Gate e raccogliere eventuali ulteriori popolazioni gliali di interesse dalla popolazione NEUN-negativa PAX6-negativa. Per il sequenziamento dell'RNA monocucleno di massa, dopo aver raccolto da 50.000 a 500.000 nuclei in PBS integrato con BSA allo 0,04%, aggiungere due millilitri di soluzione di saccarosio, 50 microlitri di cloruro di calcio monomolare e 30 microlitri di acetato di magnesio monomastre al campione.
Portare il volume finale della sospensione fino a 10 millilitri con PBS. Mescolare il contenuto del tubo per inversione e incubare la reazione sul ghiaccio per 15 minuti. Pellet i nuclei per centrifugazione e risospesso i nuclei in un millilitro di reagente di estrazione dell'RNA.
Quindi, ruotare il tubo, congelare il campione su ghiaccio secco e conservare i nuclei a meno 80 gradi Celsius. Per il sequenziamento della cromatina accettabile per la trasposasi a singolo nucleo alla rinfusa, raccogliere da 50.000 a 75.000 nuclei in PBS integrato con BSA allo 0,04% in un tubo di microcentrifuga rivestito con BSA al 5% e congelare i nuclei fino alla loro analisi a valle. Le popolazioni di nuclei progenitori neuronali, astrociti e oligodendrociti possono essere ordinate da un campione di neocorteccia temporale umana post-mortem fresco congelato, come dimostrato.
Gli studi di sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo hanno ulteriormente dato priorità a PAX6 come fattore di trascrizione nucleare differenzialmente espresso in entrambe le sottopopolazioni di astrociti adulti protoplasmatici e fibrosi. Dopo l'ordinamento, possono essere caratterizzate alterazioni del trascrittoma specifiche del tipo cellulare nella neocorteccia patologica primaria dell'epilessia. In questa analisi, le analisi trascrittomiche hanno confermato che le popolazioni NeuN-negative PAX6-positive erano robustamente arricchite per i marcatori panastrocitari e impoverite per i marcatori neuronali.
La colorazione a immunofluorescenza può essere utilizzata per confermare la co-localizzazione di PAX6 con la proteina acida fibrillare gliale negli astrociti corticali umani. Intervalli post-mortem più brevi sono associati a un maggiore recupero di nuclei intatti da campioni di tessuto fresco. Un alto rendimento di nuclei intatti può essere recuperato dal tessuto congelato fino a 24 ore dopo la mortem, ma a 30 ore, pochissimi nuclei intatti possono essere recuperati.
La cosa più importante da ricordare è ottenere la popolazione PAX6-positiva dalla popolazione NeuN-negativa, perché ci sono neuroni che esprimono anche PAX6, e vogliamo escluderli. Questa tecnica ha anche permesso lo studio degli astrociti in campioni cerebrali chirurgici di epilessia, chiarendo ulteriormente la disregolazione molecolare degli astrociti umani nel contesto di una specifica nicchia patologica.
