Bu protokol, insan astrositlerinin moleküler fonksiyonlarını doğal nişlerinde incelemek isteyen bilim insanlarına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, floresan ile aktive olmuş çekirdekleri sıralamayı kullanarak toplu insan beyin dokusu örneklerinden belirli bir hücre tipinin, yetişkin astrositlerin izole edilmesine ve zenginleştirilmesine izin vermesidir. Bu metodoloji, diğer uygun floresan konjuge antikorları kullanarak nöronlar ve oligodendrosit progenitör hücreleri gibi diğer hücre tiplerini insan neokorteksinden izole etmek için uygulanabilir.
Taze dondurulmuş bir insan yetişkin korteks doku örneğinden yaklaşık 200 ila 400 miligram doku diseksiyonuna başlayın. Dokuyu buz üzerinde dört mililitre buz gibi soğuk lizis tamponu içeren yedi mililitrelik bir cam doku dağıtıcısına yerleştirin ve dokuyu yaklaşık 50 kez öğütün. Homojenatı 12 mililitrelik ultrasantrifüj polipropilen tüpe aktarın.
Sakkaroz ve doku homojenatı arasındaki arayüzü bozmadan ultrasantrifüj tüpünün dibine 6,5 mililitre buz gibi soğuk sakkaroz tamponu eklemek için beş mililitrelik bir pipet kullanın. Çekirdekleri toplamak için, lizatı 101, 814 kez G'de bir saat boyunca ultrasantrifüj yapın ve peleti rahatsız etmeden süpernatant ve kalıntıları dikkatlice aspire edin. Çekirdek peletini yeniden askıya almadan önce buz üzerinde 10 dakikalık bir inkübasyon için PBS'de% 0.1 BSA'yı ultrasantrifüj tüpüne ekleyin.
Daha sonra, bozulmamış çekirdekleri bir ışık mikroskobu altında görselleştirmek ve konsantrasyonun mililitre başına 10 ila beşinci çekirdeğin üzerinde olmasını sağlamak için tripan mavisi kullanın İzole çekirdeklerin floresan ile aktive edilmiş sıralanması için, Alexa fluor 555 konjuge fare anti-NeuN antikoru içeren bir antikor çözeltisine yeniden askıya alınmış numunenin yaklaşık 20 mikrolitresini ekleyin. Yeniden askıya alınan numunenin yaklaşık 20 mikrolitresini, APC konjuge fare anti-PAX6 antikoru içeren bir antikor çözeltisine ekleyin. Dört santigrat derecede sallantılı, ışıktan korunan bir saatlik inkübasyondan sonra, tüm numunelere ve kontrollere 1:1000 oranında DAPI ekleyin.
Uygun büyüklükteki çekirdekleri dahil etmek ve kırmızı kan hücrelerini ve kalıntıları dışlamak için, hücreleri ileri ve yan saçılma alanlarına göre kapılamak için bir kontrol tüpü kullanın. Tekli çekirdek popülasyonunu seçmek için, ileri saçılma alanına karşı ileri saçılma genişliğine veya yüksekliğine ve yan saçılma alanına karşı yan saçılma genişliğine veya yüksekliğine karşı kapı kapı dolaşın. Sadece bozulmamış çekirdek teklilerini içerecek ve herhangi bir enkaz ve çifti dışlayacak şekilde DAPI tarafından kapı.
Ek floresan kontrollerine göre geçit yaptıktan sonra, yalnızca DAPI kontrol örneğini çalıştırın. Alexa fluor 555 kanalındaki NeuN-pozitif boyama için kesintiyi belirlemek üzere NeuN Alexa fluor 555'e özel kontrolü çalıştırın. APC kanalındaki PAX6 pozitif lekelenmenin kesilmesini belirlemek için yalnızca PAX6 APC kontrolünü çalıştırın.
Tüm kontroller yapıldıktan sonra, nöronları toplamak için NeuN-pozitif hücreleri kapıya koyun ve astrositleri toplamak için PAX6-pozitif hücreleri NeuN-negatif popülasyonla kapılayın. NeuN-negatif PAX6-negatif popülasyondan ilgilenilen ek glial popülasyonları kapılayın ve toplayın. Toplu tek çekirdekli RNA dizilimi için,% 0.04 BSA takviyeli PBS'de 50.000 ila 500.000 çekirdek topladıktan sonra, numuneye iki mililitre sakkaroz çözeltisi, 50 mikrolitre bir molar kalsiyum klorür ve 30 mikrolitre bir molar magnezyum asetat ekleyin.
PBS ile süspansiyonun son hacmini 10 mililitreye kadar getirin. Tüp içeriğini ters çevirerek karıştırın ve reaksiyonu 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Çekirdekleri santrifüjleme ile toplayın ve çekirdekleri bir mililitre RNA ekstraksiyon reaktifinde yeniden askıya alın.
Ardından, tüpü vorteksleyin, numuneyi kuru buz üzerinde dondurun ve çekirdekleri eksi 80 santigrat derecede saklayın. Toplu tek çekirdekli transpozaz-kabul edilebilir kromatin dizilimi için, %5 BSA ile kaplanmış bir mikrosantrifüj tüpünde %0,04 BSA takviyeli PBS içine 50.000 ila 75.000 çekirdek toplayın ve çekirdekleri aşağı akış analizlerine kadar dondurun. Nöronal, astrosit ve oligodendrosit progenitör çekirdek popülasyonları, gösterildiği gibi taze dondurulmuş bir postmortem insan temporal neokorteks örneğinden ayrılabilir.
Tek çekirdekli RNA dizileme çalışmaları, PAX6'yı hem protoplazmik hem de fibröz yetişkin astrositler alt popülasyonlarında diferansiyel olarak eksprese edilen bir nükleer transkripsiyon faktörü olarak daha da önceliklendirmiştir. Sıralamadan sonra, primer patolojik epilepsi neokorteksindeki hücre tipine özgü transkriptom değişiklikleri karakterize edilebilir. Bu analizde, transkriptomik analizler, PAX6-pozitif NeuN-negatif popülasyonların panastrosit belirteçleri için sağlam bir şekilde zenginleştirildiğini ve nöronal belirteçler için tükendiğini doğruladı.
İmmünofloresan boyama, PAX6'nın insan kortikal astrositlerinde glial fibriler asidik protein ile birlikte lokalizasyonunu doğrulamak için kullanılabilir. Daha kısa postmortem aralıklar, taze doku örneklerinden daha fazla bozulmamış çekirdek geri kazanımı ile ilişkilidir. Dondurulmuş dokudan 24 saat sonrasına kadar yüksek miktarda bozulmamış çekirdek geri kazanılabilir, ancak 30 saatte çok az sayıda sağlam çekirdek geri kazanılabilir.
Hatırlanması gereken en önemli şey, PAX6-pozitif popülasyonu NeuN-negatif popülasyondan almaktır, çünkü PAX6'yı da ifade eden nöronlar vardır ve bunları dışlamak istiyoruz. Bu teknik aynı zamanda epilepsi cerrahi beyin örneklerinde astrositlerin incelenmesine izin verdi ve insan astrositlerinin moleküler düzensizliğini belirli bir patolojik niş bağlamında daha da aydınlattı.
