从成人人类脑组织获取人类微胶质

该协议的总体目标是将原发性微胶质细胞与活的成人人类脑组织分离。在我们的案例中，这是作为手术窗口在手术期间收集的。这是通过最初收集脑组织在冰冷的PBS，组织然后切成1毫米立方体小块，我只是做了与尝试性EDTA的帮助下。

之后，细胞通过离心收获，并镀在适合激素细胞培养的烧瓶中48小时。细胞再次从烧瓶中收获并培养，直到进一步使用。原发性人类微胶质细胞现在可以通过使用免疫细胞化学来描述，并用于进一步的实验。

我们的协议将微胶质细胞与成人脑组织隔离的主要优点是，它以非常经济高效的方式有效地提供初级成人人类微胶质细胞。该协议是健壮的，它通过减少现有协议中使用的步骤数来减少单元的丢失。将组织收集在含有 10 mL 冰冷 aCSF 的 50 mL 猎鹰管中。

用 70% 酒精小心擦拭收集管，然后转移到无菌层气流室。小心丢弃 aCSF，在猎鹰管中称量组织。通过测量空猎鹰管的重量来计算组织的大约重量。

温暖新鲜 aCSF 到 37 摄氏度。将组织保持在温暖的ACSF中五分钟。此步骤对于避免细胞死亡至关重要。

小心丢弃 aCSF。洗组织一次与1X PBS加热到37摄氏度。确保根据需要重复洗涤所有血液。

在温暖的PBS中孵育组织5分钟。小心丢弃一半的 PBS。将组织与剩余的 PBS 一起转移到消毒的培养皿中。

使用 1 mL 移液器小心地取出剩余的 PBS。这将防止组织损失。使用无菌手术刀将问题切成至少 1 毫米立方体小块。

将 2 mL 的 0.25% trypsin EDTA 添加到 Petri 盘中，并在移液器的帮助下彻底清洗盘子。将切碎的组织转移到一个50 mL猎鹰管，每克组织含有10mL，0.25%的三辛EDTA。通过10 mL血清移液器移液器进行移液混合。

在37摄氏度和250 rpm的转速下在摇床上孵育管30分钟。添加 10 mL 中和介质以中和尝试素。与 10 mL 血清移液器彻底混合。

在 4 摄氏度的 2000G 下将管离心 10 分钟。丢弃上一杯，在1mL的培养介质中重新暂停颗粒。将细胞放在适合雷激素细胞的T25烧瓶中，并加入4mL的额外培养基。

培养物中含有20%L929上更常血和1%链霉素。建议在烧瓶中单独添加 L929 上大液，而不是添加到库存培养介质中。我们完成与烧瓶均匀处置组织。

避免在摇动时将介质带到烧瓶的颈部，因为这可能增加污染的机会。在37摄氏度的温度下用5%CO2孵育烧瓶48小时。从第 0 天在离心管中准备的 T25 培养瓶中收集介质。

在 4 摄氏度的 1，466G 下将收集的介质离心 4 分钟。当收集的介质被离心时，用 1X PBS 清洗第 0 天烧瓶一次。轻轻摇动烧瓶，清除任何残存的组织碎片。

避免烧瓶的剧烈震动，因为任何残片不会对文化产生负面影响。将 5 mL 的新鲜文化介质添加到烧瓶中。从离心管中丢弃上流液。

将1 mL的培养介质添加到其中一个管中，与移液器彻底混合。将混合介质与细胞连续添加到其他管中，并彻底混合。将细胞放在适合雷激素细胞的单独的 T25 烧瓶中。

将 4 mL 的新鲜文化介质添加到烧瓶中。用5%CO2孵育两个烧瓶，温度为37摄氏度，48小时。将介质从两个烧瓶中丢弃，并添加新鲜的 5 mL 培养介质。

在37摄氏度的温度下孵育烧瓶，在5%CO2下孵育48小时。第六天，细胞将准备好进行进一步的实验。在此表示的图像中。

第一部分的第一面板 A 星细胞沾染了 GFAP，绿色。在第二面板中，第一节的微胶质污渍与RCA，绿色的颜色。在B节中，染有RCA，颜色为绿色，星形细胞沾染了GFAP，红色为红色。

图像的叠加显示微胶质和星细胞在一起。从图像中可以清楚地知道，在培养的培养中，大多数细胞都是微胶质。图像通过盲控进行量化，结果在C节中显示，结果表明，所准备培养的培养细胞中约80%是微胶质细胞。

此技术可以在大约一个半小时后执行。遵循这个程序应该有一个很好的理解，我如何选择从成人人类脑组织注微胶质，这需要进一步用于下游实验。