聚焦激光扫描显微镜为基础的定量分析 阿斯珀吉卢斯熏蒸 孔尼迪亚分布在全山光学清除鼠肺

我们的方法使我们能够对全安装光学清除鼠肺中的阿斯珀吉卢斯熏蒸孔径分布进行定量分析。阿斯珀吉卢斯熏蒸孔尼迪亚可以穿透呼吸道，在免疫功能低下的患者中引起危及生命的疾病。哺乳动物的呼吸道是不同世代的气道系统。

每一代人的特点是气道壁和免疫细胞群的不同结构。在支气管分支中，通过粘结清除消灭阿斯珀吉卢斯熏蒸科尼迪亚。然而，在可用的空间，粘血清隙不起作用，Conidia必须由免疫细胞清除，如藻类巨噬细胞和嗜中性粒细胞。

与气道中康尼迪亚分布的空间时间方面一样，也很重要。但是，在了解疾病机制时没有对问题进行适当调查。在这里，我们提出了一个实验设置，用于定量分析阿斯珀吉卢斯富米加图斯康尼迪亚分布在受感染小鼠的气道。

我用50微升标记的阿斯珀吉卢斯熏蒸康尼迪亚到老鼠。六小时后，收获肺。用标有斯特雷普塔维丁结合物的2%甲醛和污渍过夜。

然后将标本置于光学清除中。将样品放入装满50%甲醇水溶液的玻璃瓶中，并在室温下放入样品搅拌机一小时。用100%甲醇代替50%甲醇，放在样品搅拌机下两小时。

准备一种混合物，由一部分苯甲酸酯和两部分苯甲酸酯组成。将标本转移到24井板，用苯甲酸酯混合物覆盖至少30分钟。样品已准备好成像。

将样品放在样品支架上。并将支架放在显微镜中。打开显微镜系统并打开软件后，打开传输灯并选择 X 目标。

在传输灯中直观地定位您的样品，然后进入采集选项卡。选择协焦激光显微镜兰姆达模式。打开适当的激光。

设置探测器的光谱范围并选择二色镜。调整探测器增益，将针孔缩小到一个区域单元。将像素分辨率设置为 512 乘 512。

打开 zed 堆栈模式并开始实时成像。查找两个骰子都可见的焦点平面。扩展 zed 堆栈面板。

使用对焦轮，查找并选择样品中最低和最高的平面。将焦点平面放在样品底部旁边。关闭 zed 堆栈模式并打开拨号扫描模式。

如有必要，调整 X、Y 位置和瓷砖数量。打开 zed 堆栈并打开拨号扫描模式。将分片步设置为五微米。

设置扫描速度。开始实验。成像通常需要几个小时取决于土地大小和扫描速度。

然后，获得的图像将未混合。对于光谱未混合，请使用线性未混合选项。选择与标有链球菌素和康尼迪亚的陆地区域相对应的区域。

开始解密。拆混后保存未混合文件。要从获得的图像中取出瓷砖，打开图像。

选择方法，几何拼接。在输入窗口中选择图像。在拼接选项中，选择新的输出和融合瓷砖选项。

使用与气道荧光对应的选定通道的参考模式。在剩余的 3D 视图中打开图像。如果需要，更改用于演示的颜色。

在这里，我们显示灰色色调的气道通道和紫色的康尼迪亚通道。要创建气道掩码，请使用添加新的表面工具。选择气道通道，选择10微米的平滑参数。

各种过滤器可用于排除气道信号。首先，目视检查表面并设置强度阈值。其他过滤器，如表面积，也可以应用于专门选择气道，但不能用于普鲁拉或血管。

接下来，手动删除不属于气道的选定表面片段。现在，您可以观察创建的表面并调查缺失的部分，以便稍后更正它们。使用选项编辑和掩蔽所有选项，为气道表面创建一个掩码。

选择气道通道，将表面外的工作单元设置为 0.001。在这里，我们展示了由此产生的橙色面具。保存康尼迪亚通道和气道面罩在两个单独的文件夹，作为T的F系列。

使用气道掩蔽图像打开文件。使图像二进制。按照过程二进制，使二进制。

要类似于面膜厚度，请应用多个扩散 3D 功能。按照插件、工艺、3D 拉脂。您也可以使用宏功能来做到这一点。

经过几个周期的扩散过程，使用填充孔功能。按照流程，二进制，填充孔。要手动填充掩码中的剩余孔，请打开兴趣经理区域。

跟随分析，工具，投资回报率经理。使用多边形选择工具选择应在特定投影中填充的区域。在 zed 堆栈中对很少的投影进行多次此操作，以便您可以插值感兴趣区域的形状。

要对所选形状进行插值，请选择所有形状并按下更多，从而对 ROI 进行插值。然后用白色填充所有 ROI。再次使用填充孔程序。

要在填充孔后重新组合面膜厚度，请应用侵蚀的 3D 功能。按照插件，过程，侵蚀3D。您也可以为此使用微卡。

侵蚀 3D 和 LA 3D 中的迭代数应相等。启动康尼迪亚计数应用程序。按下添加文件按钮，选择带有 DIFF 文件的文件夹，其中包含准备好的气道面罩和 Conidia 荧光图像。

将自定义阈值设置在零到 1 之间。按好，查看结果。使用此方法，我们在康尼迪亚应用后六小时对小鼠支气管树内外的Conidia进行定量分析。

数据表明，在我们最初的应用，大多数Conidia穿透阿尔韦奥拉空间，并分配在那里在炎症免疫反应的开始。用共聚焦激光扫描显微镜对小鼠肺部进行三维成像，从而在气道中识别阿斯珀吉卢斯·福米加图斯·科尼迪亚。使用此协议处理三维图像允许对支气管分支内外的 Conidia 分布进行定量分析。

我们的方法也可以用来估计Conidia从小鼠的外侧消除的动能，并比较解剖Conidia分布在免疫能力和免疫功能低下的小鼠。此外，使用这种方法，可以分析微粒或纳米粒子在气道中聚集的分布。