우리의 접근 은 우리가 전체 마운트 광학 적으로 지워진 마우스 폐에서 아스퍼 질러스 fumigatus Conidia 분포의 정량적 분석을 수행 할 수 있습니다. 아스퍼 질러스 fumigatus Conidia는 호흡기를 관통하고 면역 손상 환자에서 생명을 위협하는 질병을 일으킬 수 있습니다. 포유류의 호흡기는 다른 세대의 기도 시스템입니다.
각 세대는 기도 벽과 면역 세포 집단의 다른 구조물에 의해 특징입니다. 기관지 가지에서, 아스퍼질러스 fumigatus Conidia점 점막 통관에 의해 제거됩니다. 그러나, 사용 가능한 공간에서, 점막 정리는 작동하지 않으며 Conidia는 폐포 대식세포 및 호중구와 같은 면역 세포에 의해 삭제되어야 합니다.
기도에서 코니디아 분포의 공간 측두적인 측면도 중요합니다. 그러나 질병 메커니즘을 이해하는 데 문제를 제대로 조사하지 는 못했습니다. 여기서 우리는 감염된 마우스의 기도에서 아스퍼질러스 퓨미가투스 코니디아 분포의 정량적 분석을 위한 실험적인 설정을 제시합니다.
나는 마우스에 라벨 아스퍼 질러스 fumigatus Conidia의 50 마이크로 리터를 적용합니다. 6시간 후, 폐를 수확하십시오. 라벨이 붙은 스트렙타비딘 컨쥬게이트로 2% 포름알데히드와 얼룩으로 하룻밤을 고정하십시오.
그런 다음 시편을 광학 지우기로 바목합니다. 50%의 메탄올 물 용액으로 채워진 유리 병에 표본을 넣고 실온에서 샘플 믹서에 1시간 동안 놓습니다. 50% 메탄올을 100% 메탄올로 교체하고 2시간 동안 시료 믹서 아래에 놓습니다.
벤지 알코올 1부와 벤지벤조아테의 2부로 구성된 혼합물을 준비한다. 시편을 24웰 플레이트로 옮기고 벤지 벤조아테 혼합물로 30분 이상 덮습니다. 샘플은 이미징을 위한 준비가 되어 있습니다.
샘플 홀더에 샘플을 놓습니다. 그리고 현미경에 홀더를 배치합니다. 현미경 시스템을 켜고 소프트웨어를 열면 전송 라이트를 켜고 X 목표를 선택합니다.
전송 표시등에서 샘플을 시각적으로 찾아 수집 탭으로 진행합니다. 공초점 레이저 현미경 람다 모드를 선택합니다. 적절한 레이저를 켭타보시고
검출기의 스펙트럼 범위를 설정하고 이색 거울을 선택합니다. 검출기 게인을 조정하고 핀홀을 한 영역 단위로 좁히게 합니다. 픽셀 해상도를 512x512로 설정합니다.
zed 스택 모드를 켜고 라이브 이미징을 시작합니다. 주사위가 모두 보이는 초점 평면을 찾습니다. zed 스택 패널을 확장합니다.
초점 휠을 사용하여 샘플의 가장 낮은 평면과 가장 높은 평면을 찾아 선택합니다. 시료의 하단 옆에 초점 평면을 배치합니다. zed 스택 모드를 끄고 스캔 모드를 켭니다.
필요한 경우 X, Y 위치 및 타일 수를 조정합니다. zed 스택을 켜고 검색 모드를 다이얼합니다. 제드 단면 단계를 5미크론으로 설정합니다.
스캔 속도를 설정합니다. 실험을 시작합니다. 이미징은 일반적으로 토지 크기와 스캐닝 속도에 따라 몇 시간이 걸립니다.
그런 다음 얻은 이미지가 반사적으로 혼합되지 않습니다. 스펙트럼 혼합 해제의 경우 선형 언믹싱 옵션을 사용합니다. 스트렙타비딘과 코니디아로 표시된 토지 지역에 해당하는 지역을 선택합니다.
믹싱 을 해제 시작합니다. 혼합 해제 후 혼합되지 않은 파일을 저장합니다. 획득한 이미지에서 타일을 고정하려면 이미지를 엽니다.
방법, 기하학적 스티칭을 선택합니다. 입력 창에서 이미지를 선택합니다. 스티치 옵션에서 새 출력을 선택하고 타일 옵션을 융합합니다.
기도 형광에 해당하는 선택된 채널과 참조 모드를 사용합니다. 잉여 3D 뷰에서 이미지를 엽니다. 필요한 경우 프레젠테이션에 사용되는 색상을 변경합니다.
여기에 우리는 회색 음영과 보라색 코니디아 채널에 기도 채널을 보여줍니다. 기도 마스크를 만들려면 새 표면 도구를 추가하십시오. 기도 채널을 선택하고 10 미크론의 스무딩 매개 변수를 선택합니다.
다양한 필터를 사용하여 기도 신호에서 제외할 수 있습니다. 먼저 표면을 육안으로 검사하고 강도 임계값을 설정합니다. 표면적과 같은 추가 필터는 독점적으로 선택된 기도에 적용될 수 있지만 흉막이나 혈관은 적용되지 않습니다.
그런 다음 기도에 속하지 않는 선택한 표면 조각을 수동으로 삭제합니다. 이제 생성된 서피스를 관찰하고 누락된 부품을 조사하여 나중에 수정할 수 있습니다. 옵션 편집 및 마스크 모두를 사용하여 기도 표면에 대한 마스크를 만듭니다.
기도 채널을 선택하고 표면 외부의 작업 셀을 0.001로 설정합니다. 여기서 우리는 주황색으로 결과 마스크를 보여 주었다. F 시리즈의 T로, 두 개의 별도의 폴더에 코니디아 채널과 기도 마스크를 저장합니다.
기도 마스크 이미지로 파일을 엽니다. 이미지 바이너리를 만듭니다. 프로세스 바이너리를 따라 바이너리를 만듭니다.
마스크 두께를 유사하게 하려면 여러 개의 팽창 3D 함수를 적용합니다. 플러그인을 따르십시오, 프로세스, 3D를 팽창. 매크로 기능을 사용하여 이 작업을 수행할 수도 있습니다.
여러 주기의 팽창 프로세스 후에 채우기 구멍 함수를 사용합니다. 프로세스, 바이너리, 채우기 구멍을 따르십시오. 마스크의 잔여 구멍을 수동으로 채우려면 관심 관리자 영역을 엽니다.
분석, 도구, ROI 관리자를 따르십시오. 다각형 선택 도구를 사용하여 특정 프로젝션에서 채워야 하는 영역을 선택합니다. 관심 영역의 모양을 보간할 수 있도록 zed 스택의 몇 가지 투영에 대해 여러 번 이 작업을 수행합니다.
선택한 셰이프를 보간하려면 모든 셰이프를 선택하고 더 많이 눌러 ROI를 보간합니다. 그런 다음 모든 ROI를 흰색으로 채웁니다. 채우기 구멍 절차를 다시 한 번 사용합니다.
구멍을 채운 후 마스크 두께를 다시 조립하려면 침식된 3D 기능을 적용합니다. 플러그인을 따르십시오, 프로세스, 3D침식. 당신은 또한 이것에 대 한 현미경을 사용할 수 있습니다.
침식된 3D 및 LA 3D의 반복 수는 같아야 합니다. 코니디아 카운트 응용 프로그램을 시작합니다. 추가 파일 버튼을 누르고 준비된 기도 마스크와 Conidia 형광 이미지가있는 DIFF 파일이있는 폴더를 선택합니다.
0에서 1 사이의 사용자 지정 임계값을 설정합니다. 확인을 누르고 결과를 참조하십시오. 이러한 접근법을 이용하여, 우리는 Conidia 적용 후 6시간 후에 생쥐의 기관지 나무 안팎의 코니디아의 정량적 분석을 수행한다.
데이터는 우리의 원래 응용 프로그램에, Conidia의 대부분은 알베올라 공간을 관통하고 염증성 면역 반응의 시작 부분에 거기에 할당 것을 시사한다. 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사를 가진 마우스 폐의 3차원 화상 진찰은 기도에 있는 아스퍼질러스 fumigatus Conidia의 확인을 허용합니다. 이 프로토콜을 사용하여 3차원 이미지를 처리하면 기관지 내외의 Conidia 분포를 정량적 분석할 수 있습니다.
우리의 접근은 또한 마우스의 멀리에서 Conidia 제거의 운동학을 추정하고 면역 무능하고 면역 손상한 마우스에 있는 해부학 적인 Conidia 분포를 비교하기 위하여 이용될 수 있습니다. 또한, 이러한 접근법을 이용하여, 공수내의 미세입자 또는 나노 입자의 분포를 분석할 수 있다.
