体外 使用小鼠胚胎干细胞进行血管疾病建模和药物测试的血管生成的三维发芽测定

该协议描述了一种体外发芽血管生成测定，该测定概括了血管形成的许多特征，可用于测试药物。此方法易于在实验室中实现、可靠且可扩展。它与使用人内皮细胞和微球的测定有许多相似之处。

该模型有力地模拟了表型，显示内皮尖端细胞选择缺陷和定向内皮细胞迁移，导致病理性血管生成。这项工作可以提供对调节发芽血管生成，关键基因和所涉及的信号通路的机制的见解，特别是通过进行基因筛选 主要挑战是保持培养中小鼠胚胎干细胞的质量或多能性。定期检查细胞系的多能性阶段和形态很重要。

对细胞系进行核型分析也很重要，因为它们倾向于培养失去或获得染色体。首先用500微升0.1%明胶溶液涂覆六孔细胞培养板的一个孔，并将其置于二氧化碳培养箱中30分钟。然后用PBS清洗明胶涂层板，并加入500微升新鲜制备的CM加减号培养基。

为了获得纯的小鼠胚胎干细胞或mESCs群体，在室温下用10x TVP缓冲液胰蛋白酶消化细胞培养板30秒。然后将细胞重悬于一毫升中胚层分化培养基中，然后将它们转移到涂有明胶的六孔板中30分钟，以使小鼠胚胎成纤维细胞附着，同时mESC保持悬浮状态。将细胞悬液转移到15毫升管中，然后使用台盼蓝染料中的Neubauer血细胞计数器计数活细胞。

然后在室温下以200倍G离心细胞5分钟。除去上清液并将细胞沉淀重悬于适当体积的中胚层分化培养基中。通过在底部添加 15 毫升无菌水来准备四个 94 毫米低附着聚苯乙烯培养皿。

将细胞悬液转移到无菌塑料储液槽中后，每通道加载多通道移液器的四个位置，每通道22微升细胞悬液。提起 94 毫米培养皿的倒盖并将其放在流动柜的干净表面上，内侧朝上。在每个盖子的内表面上沉积40滴细胞悬浮液，并小心地将盖子倒置而不会受到干扰，将其放回培养皿上，使滴液面向水。

将培养皿在二氧化碳培养箱中孵育四天，将其视为分化零天。孵育四天后，使用P1000移液管将悬挂液滴收集在15毫升锥形管中。在除去上清液之前，让EB沉淀在管中。

将EB重悬于3毫升2x血管分化培养基中，然后将EB悬浮液转移并均匀分布在60毫米琼脂包被的培养皿中。将培养皿在二氧化碳培养箱中孵育至第九天，每两天进行一次培养基更新。通过在底部加入一毫升发芽培养基来准备 35 毫米培养皿。

要诱导凝胶化，请将培养皿在 37 摄氏度下孵育五分钟。从15毫升锥形管中的一个琼脂培养皿中收集9天大的EB，并除去上清液。将EB重悬于两毫升冷发芽培养基中，以转移到涂有第一层发芽培养基的培养皿中。

将EB分布在整个板上，确保它们彼此之间的距离相等。孵育约 24 至 48 小时后，第一次发芽形成应该很明显。在第12天，使用刮刀小心地将含有EB的胶原蛋白凝胶转移到载玻片上。

用移液管除去多余的液体，并通过在凝胶顶部放置尼龙亚麻纱布片和吸收性滤芯来脱水凝胶。以 250 克的重量施加压力两分钟。然后取出尼龙纸，让载玻片在室温下风干 30 分钟。

干燥后，使用锌溶液在四摄氏度下固定EB过夜。第二天，在用PBS清洗载玻片五次之前，取出固定剂。透化含有0.1%Triton X-100的EB和PBS。

15分钟后，取出透化溶液，用PBS清洗载玻片五次，持续五分钟。将EB在封闭缓冲液中在室温下孵育一小时，并用PBS洗涤五分钟。然后加入在封闭缓冲液中稀释的一抗，并在4摄氏度下孵育过夜。

然后将载玻片与山羊抗鼠Alexa 555二抗在封闭缓冲液中在室温下孵育两小时。孵育后，用PBS洗涤载玻片三次五分钟，用水洗涤一次，然后安装它们进行显微镜检查。使用两种药物DC101和DAPT对三个EB进行3D发芽血管生成测定。

随着浓度的增加，两种化合物都逐渐阻断EB模型中的血管生成。EB中不同浓度的药物表明，高剂量的DC101抑制血管芽的数量和长度。DAPT在每升一微摩尔的剂量下具有相反的作用。

与DC101相比，DAPT强烈增加了即使在低剂量下也具有误导表型的每个血管芽的内皮尖端细胞数量。在ACVRL1对照和ACVRL1杂合基因型的遗传性出血性毛细血管扩张EB中观察到有缺陷的血管发芽，许多误导表型相对于亲本血管以随机角度萌发。野生型mESC系与未标记的mESC野生型细胞系以一比一的比例混合，导致对领先的内皮尖端细胞的相同贡献。

对该具有代表性的嵌合EB进行显微镜分析，以确定领先的内皮尖端细胞的基因型来源。为了量化血管芽的壁细胞覆盖率，将EB固定并染色为内皮细胞标志物PECAM和壁细胞标志物α平滑肌肌动蛋白。高放大倍率图像显示，一个单独的血管发芽被壁画细胞包围。

在颜色通道分离后进行二元转化，并量化α SMA阳性壁细胞覆盖的PECAM阳性血管的比例。胚胎干细胞系的遗传背景也是研究人员必须考虑的关键因素，因为有些细胞系比其他系发芽得更好。该方法可用于使用RNAi方法或携带基因突变的小鼠胚胎干细胞库进行遗传筛选。