利用 体内 出生后电穿孔研究小脑颗粒神经元形态和突触发育

该协议研究不同发育阶段的小脑颗粒神经元，以可视化关键的形态生长。该技术的优点包括细胞特异性靶向，转染构建体的快速表达以及细胞的稀疏标记，从而可以研究细胞自主效应。首先从加载移液器吸头上切下 11.2 毫米段，然后将切割部分放在汉密尔顿注射器的尖端作为垫片上，以将注射深度限制在 1.5 毫米。

用粘合剂或封口膜将垫片固定在注射器尖端上。为了研究实验幼犬矢状脑切片的单个电穿孔 CGN 的形态，请在共聚焦显微镜上以每叠 0.5 微米的速度拍摄 Z 堆栈图像。每个图像窗口对一个单元格进行成像，以便于图像分析和3D重建。

使用简单的神经突示踪剂以盲方式分析神经突长度和树突爪形成。将电穿孔CGN的单通道Z堆栈图像上传到斐济，然后单击插件"分割"和简单的神经突示踪剂"选择创建新的3D查看器"从下拉菜单中。滚动到连接到细胞体的树突的底部，然后单击连接处开始路径。

通过单击单元格填充信号最亮的部分并按 Y 保留跟踪来手动跟踪路径。追踪直到枝晶的末端，然后按F确认路径。或者，追踪到爪子的底部。接下来，从结构的底部到最长的神经突的末端追踪爪子。

通过按住 Windows 上的控制或 macOS 上的 ALT 并单击路径来跟踪二级和三级分支。按 F.观察迹线的测量值是否在单独的窗口中可见，以确认路径的路径。将爪子分支的所有大小相加，得到每个爪子的总长度。

在代表性分析中，注射后3至14天的电穿孔CGN的投影图像显示树突数量逐渐减少。CGN经历了树枝状生长的阶段，然后从3 DPI细化到7 DPI，导致修剪了超过50%的多余树突。这一事件与剩余的乔木在每个枝晶末端形成爪状结构的逐渐延长相吻合，表明这些发育过程同时发生。

到7 DPI，在大约75%的树突上发现了爪子。每个标记的CGN在NMRS中重建，以量化总体细胞 - 树枝状表面积和体积。在整个开发过程中，CGN 大小没有观察到显着差异。

虽然在 7 DPI 时，CGN 的体积与 3、5 和 10 DPI 相比显着减少了 20%。手术中最重要的是在注射前准确定位小脑。该方法可以适用于体内基因的遗传操作，以通过转染shRNA，siRNA或Cre重组酶来研究它们在颗粒神经元发育中的作用。