このプロトコルは、主要な形態学的成長を視覚化するために、発達のさまざまな段階にわたる小脳顆粒ニューロンを研究します。この技術の利点には、細胞特異的ターゲティング、トランスフェクトされたコンストラクトの高速発現、および細胞の自律効果の研究を可能にする細胞のスパース標識が含まれます。ローディングピペットチップから11.2ミリメートルのセグメントを切断することから始め、カット部分をスペーサーとしてハミルトンシリンジの先端に配置して、注入深さを1.5ミリメートルに制限します。
シリンジチップのスペーサーを接着剤またはパラフィルムで固定します。実験用仔の矢状脳切片から単一のエレクトロポレーションCGNの形態を研究するには、共焦点顕微鏡でスタックあたり0.5マイクロメートルのZスタック画像を撮影します。画像ウィンドウごとに1つのセルを画像化して、画像分析と3D再構成を容易にします。
神経突起の長さと樹状突起の爪形成を、単純な神経突起トレーサーを用いて盲検化して解析します。エレクトロポレーションされたCGNのシングルチャンネルZスタック画像をフィジーにアップロードし、をクリックします プラグイン「セグメンテーション」とシンプルな神経突起トレーサー「ドロップダウンメニューから[新しい3Dビューアの作成]を選択します。セルソーマに接続する樹状突起の基部までスクロールし、接合部をクリックしてパスを開始します。
セル塗りつぶし信号が最も明るいセクションをクリックし、Yを押してトレースを保持することにより、パスを手動でトレースします。樹状突起の端までトレースし、Fを押してパスを確認しますまたは、爪の付け根までトレースします。次に、構造の基部から最も長い神経突起の端まで爪をたどります。
二次および三次ブランチをトレースするには、ウィンドウのコントロールまたはmacOSのALTを押したままパスをクリックします。Fを押してパスを確認します。トレースの測定値が別のウィンドウに表示されていることを確認します。爪の枝のすべてのサイズを合計して、各爪の全長を求めます。
代表的な解析では、注入後3日から14日までのエレクトロポレーションCGNの投影画像は、樹状突起数の漸進的な減少を示しました。CGNは樹状突起の成長段階を経て、3 DPIから7 DPIに改良され、その結果、過剰な樹状突起の50%以上が剪定されました。この出来事は、各樹状突起の終わりに爪のような構造の形成における残りのアーバーの漸進的な延長と一致しており、これらの発生過程が同時に起こっていることを示しています。
7 DPIまでに、樹状突起の約75%に爪が見つかりました。各標識CGNをNMRSで再構築し、体性樹状突起の総表面積と体積を定量化しました。開発全体でCGNサイズに有意差は観察されなかった。
7 DPIではありますが、CGNは3、5、および10 DPIと比較して体積が20%大幅に減少しました。手順で最も重要なことは、注射前に小脳を正確に特定することです。この方法は、in vivoで遺伝子を遺伝子操作して、shRNA、siRNA、またはCreリコンビナーゼのいずれかのトランスフェクションによる顆粒ニューロンの発生における遺伝子の役割を研究するように適合させることができます。
