Das Protokoll untersucht Kleinhirngranula-Neuronen in verschiedenen Entwicklungsstadien, um das morphologische Wachstum von Schlüsseln zu visualisieren. Zu den Vorteilen der Technik gehören zellspezifisches Targeting, schnelle Expression von transfizierten Konstrukten und spärliche Markierung von Zellen, die die Untersuchung zellautonomer Effekte ermöglicht. Beginnen Sie mit dem Schneiden eines 11,2-Millimeter-Segments von einer Ladepipettenspitze und legen Sie das geschnittene Teil als Abstandshalter über die Spitze der Hamilton-Spritze, um die Injektionstiefe auf 1,5 Millimeter zu begrenzen.
Befestigen Sie den Abstandshalter mit Klebstoff oder Parafolie an der Spritzenspitze. Um die Morphologie einzelner elektroporierter CGNs aus sagittalen Hirnschnitten des experimentellen Welpen zu untersuchen, nehmen Sie Z-Stapel-Bilder mit 0,5 Mikrometern pro Stapel auf einem konfokalen Mikroskop auf. Bilde eine Zelle pro Bildfenster, um eine einfache Bildanalyse und 3D-Rekonstruktion zu ermöglichen.
Analysieren Sie die Neuritenlänge und die dendritische Klauenbildung verblindet mit einem einfachen Neuriten-Tracer. Laden Sie Einkanal-Z-Stack-Bilder von elektroporierten CGNs nach Fidschi hoch und klicken Sie auf Plugins"Segmentierung"und Simple Neurite Tracer"Wählen Sie Neuen 3D-Viewer erstellen"aus dem Dropdown-Menü. Scrollen Sie zur Basis eines Dendriten, der sich mit dem Zellsoma verbindet, und starten Sie einen Pfad, indem Sie auf die Kreuzung klicken.
Verfolgen Sie den Pfad manuell, indem Sie durch die Abschnitte klicken, in denen das Zellenfüllsignal am hellsten ist, und Y-Taste drücken, um die Spur beizubehalten. Verfolgen Sie bis zum Ende des Dendriten und bestätigen Sie den Pfad durch Drücken von F.Alternativ können Sie bis zur Basis der Klaue verfolgen. Als nächstes verfolgen Sie die Klaue von der Basis der Struktur bis zum Ende des längsten Neuriten.
Verfolgen Sie sekundäre und tertiäre Zweige, indem Sie die Strg-Taste unter Windows oder die ALT-Taste unter macOS gedrückt halten und auf den Pfad klicken. Bestätigen Sie den Pfad, indem Sie F drücken.Beachten Sie, dass die Messungen für die Leiterbahnen in einem separaten Fenster sichtbar sind. Addieren Sie alle Größen der Klauenzweige, um die Gesamtlänge für jede Klaue zu erhalten.
In der repräsentativen Analyse zeigten Projektionsbilder von elektroporierten CGNs von 3 bis 14 Tagen nach der Injektion eine fortschreitende Abnahme der Anzahl der Dendriten. CGNs durchliefen eine Phase des dendritischen Wachstums, gefolgt von einer Verfeinerung von 3 DPI auf 7 DPI, die dazu führte, dass mehr als 50% der überschüssigen Dendriten beschnitten wurden. Dieses Ereignis fällt mit der allmählichen Verlängerung der verbleibenden Dorne bei der Bildung klauenartiger Strukturen am Ende jedes Dendriten zusammen, was darauf hindeutet, dass diese Entwicklungsprozesse gleichzeitig ablaufen.
Bei 7 DPI wurden Krallen bei etwa 75% der Dendriten gefunden. Jedes markierte CGN wurde in NMRS rekonstruiert, um die gesamte somato-dendritische Oberfläche und das Volumen zu quantifizieren. Es wurde kein signifikanter Unterschied in der CGN-Größe über die Entwicklung hinweg beobachtet.
Obwohl CGNs bei 7 DPI einen signifikanten Rückgang des Volumens um 20 % im Vergleich zu 3, 5 und 10 DPI aufwiesen. Das Wichtigste bei dem Verfahren ist, das Kleinhirn vor der Injektion genau zu lokalisieren. Die Methode kann angepasst werden, um Gene in vivo genetisch zu manipulieren, um ihre Rolle bei der Entwicklung von Körnerneuronen durch Transfektion von shRNAs, siRNAs oder Cre-Rekombinase zu untersuchen.
