이 프로토콜은 주요 형태학적 성장을 시각화하기 위해 다양한 발달 단계에 걸쳐 소뇌 과립 뉴런을 연구합니다. 이 기술의 장점으로는 세포 특이적 표적화, 형질주입된 구조체의 빠른 발현, 세포 자율 효과 연구를 가능하게 하는 세포의 희소 라벨링이 있습니다. 로딩 피펫 팁에서 11.2mm 세그먼트를 절단하는 것으로 시작하여 절단 부분을 해밀턴 주사기 끝 부분에 스페이서로 배치하여 주입 깊이를 1.5mm로 제한합니다.
주사기 팁의 스페이서를 접착제 또는 파라필름으로 고정합니다. 실험 강아지의 시상 뇌 섹션에서 단일 전기천공된 CGN의 형태를 연구하려면 컨포칼 현미경에서 스택당 0.5마이크로미터의 Z 스택 이미지를 촬영합니다. 이미지 창당 하나의 셀을 이미지화하여 이미지 분석 및 3D 재구성이 용이합니다.
간단한 신경돌기 추적자를 사용하여 맹검 방식으로 신경돌기 길이와 수지상 발톱 형성을 분석합니다. 전기천공된 CGN의 단일 채널 Z 스택 이미지를 피지에 업로드하고 플러그인"세그멘테이션"및 Simple Neurite Tracer"드롭다운 메뉴에서 새 3D 뷰어 만들기"를 선택합니다. 셀 소마에 연결되는 수상 돌기의 바닥으로 스크롤하고 접합부를 클릭하여 경로를 시작하십시오.
셀 채우기 신호가 가장 밝은 섹션을 클릭하고 Y를 눌러 추적을 유지하여 경로를 수동으로 추적합니다. 수상 돌기의 끝까지 추적하고 F를 눌러 경로를 확인하십시오. 다음으로, 구조물의 바닥에서 가장 긴 중성암의 끝까지 발톱을 추적합니다.
Windows에서 Control을 누르거나 macOS에서 ALT를 누른 상태에서 경로를 클릭하여 2차 및 3차 분기를 추적합니다. F.Observe trace에 대한 측정값이 별도의 창에 표시되는지 확인하여 경로를 확인합니다. 발톱 가지의 모든 크기를 더하여 각 발톱의 전체 길이를 구합니다.
대표적인 분석에서, 주입 후 3일에서 14일 사이에 전기천공된 CGN의 투영 이미지는 수상돌기 수의 점진적인 감소를 보여주었습니다. CGN은 수지상 성장 단계를 거친 후 3DPI에서 7DPI로 개선되어 초과 수상돌기의 50% 이상이 가지치기되었습니다. 이 사건은 각 수상 돌기의 끝에 발톱과 같은 구조가 형성되는 나머지 아버가 점진적으로 길어지는 것과 일치하며, 이는 이러한 발달 과정이 동시에 일어나고 있음을 나타냅니다.
7 DPI에 의해, 발톱은 약 75 %수상 돌기의. 표지된 각 CGN은 총 체성-수지상 표면적 및 부피를 정량화하기 위해 NMRS에서 재구성되었습니다. 개발 전반에 걸쳐 CGN 크기의 유의미한 차이는 관찰되지 않았습니다.
7DPI에서 CGN은 3, 5 및 10 DPI에 비해 볼륨이 크게 20% 감소했습니다. 시술에서 가장 중요한 것은 주사 전에 소뇌를 정확하게 찾는 것입니다. 이 방법은 shRNA, siRNA 또는 Cre Recombinase의 형질감염에 의해 과립 뉴런 발달에서 그들의 역할을 연구하기 위해 생체 내에서 유전자를 유전적으로 조작하는 데 적용할 수 있습니다.
