الاستفادة من التثقيب الكهربائي بعد الولادة في الجسم الحي لدراسة مورفولوجيا الخلايا العصبية الحبيبية المخيخية وتطوير المشبك

يدرس البروتوكول الخلايا العصبية الحبيبية المخيخية عبر مراحل مختلفة من التطور من أجل تصور النمو المورفولوجي الرئيسي. تشمل مزايا هذه التقنية الاستهداف الخاص بالخلية ، والتعبير السريع عن التركيبات المنقولة ، ووضع العلامات المتناثرة للخلايا التي تسمح بدراسة التأثيرات المستقلة للخلية. ابدأ بقطع قطعة 11.2 ملم من طرف ماصة التحميل وضع الجزء المقطوع فوق طرف حقنة هاملتون كفاصل للحد من عمق الحقن إلى 1.5 ملم.

تأمين فاصل على طرف حقنة مع لاصق أو parafilm. لدراسة مورفولوجيا CGNs أحادية الكهرباء من أقسام الدماغ السهمي للجرو التجريبي ، التقط صور Z-stack بمعدل 0.5 ميكرومتر لكل كومة على مجهر متحد البؤر. صورة خلية واحدة لكل نافذة صورة للسماح بسهولة تحليل الصورة وإعادة بناء 3D.

تحليل طول الخلايا العصبية وتشكيل المخلب التغصني بطريقة عمياء باستخدام متتبع عصبي بسيط. قم بتحميل صور Z-stack أحادية القناة لشبكات CGN المكهربة إلى فيجي وانقر على المكونات الإضافية "التجزئة" و Simple Neurite Tracer "حدد إنشاء عارض 3D جديد" من القائمة المنسدلة. قم بالتمرير إلى قاعدة التغصنات المتصلة بالخلية سوما وابدأ مسارا بالنقر فوق التقاطع.

تتبع المسار يدويا بالنقر فوق الأقسام التي تكون فيها إشارة تعبئة الخلية أكثر سطوعا والضغط على Y للاحتفاظ بالتتبع. تتبع حتى نهاية التغصنات وتأكيد المسار بالضغط على F.بدلا من ذلك ، تتبع حتى قاعدة المخلب. بعد ذلك ، تتبع المخلب من قاعدة الهيكل حتى نهاية أطول عصب.

تتبع الفروع الثانوية والثالثية عن طريق الضغط باستمرار على Control على النوافذ أو ALT على macOS والنقر فوق المسار. قم بتأكيد المسار بالضغط على F.لاحظ أن قياسات التتبعات مرئية في نافذة منفصلة. اجمع جميع أحجام فروع المخلب للحصول على الطول الإجمالي لكل مخلب.

في التحليل التمثيلي ، أظهرت صور الإسقاط ل CGNs المكهربة من 3 إلى 14 يوما بعد الحقن انخفاضا تدريجيا في عدد الزوائد الشجيرية. خضعت CGNs لمرحلة من النمو الشجيري تلاها صقل من 3 DPI إلى 7 DPI مما أدى إلى تقليم أكثر من 50٪ من التشعبات الزائدة. يتزامن هذا الحدث مع الإطالة التدريجية للعرش المتبقية في تكوين هياكل تشبه المخلب في نهاية كل تغصنات تشير إلى أن هذه العمليات التنموية تحدث بشكل متزامن.

بحلول 7 DPI ، تم العثور على مخالب على ما يقرب من 75 ٪ من التشعبات. تم إعادة بناء كل CGN المسمى في NMRS لتحديد إجمالي مساحة وحجم السطح التغصني الجسدي. لم يلاحظ أي اختلاف كبير في حجم CGN عبر التنمية.

على الرغم من أنه عند 7 DPI ، أظهرت CGNs انخفاضا كبيرا بنسبة 20٪ في الحجم مقارنة ب 3 و 5 و 10 نقطة في البوصة. أهم شيء في الإجراء هو تحديد موقع المخيخ بدقة قبل الحقن. يمكن تكييف الطريقة لمعالجة الجينات وراثيا في الجسم الحي لدراسة دورها في تطور الخلايا العصبية الحبيبية عن طريق نقل إما shRNAs أو siRNAs أو Cre Recombinase.