使用废培养基对人类植入前胚胎进行染色体筛选:样品采集和染色体倍性分析

该方案是基于人类植入前胚胎的非侵入性染色体筛选 NICS 对培养基收集和染色体倍性分析进行标准化。NICS的主要优点是操作简单，而不是TiDieR显微操作，省时，并有效减少侵入性活检样本的损失。采样方法非常灵活。

在这里，我们为您提供两种不同的选择，一种用于常规顺序胚胎培养，另一种用于一步培养。这些是我们团队的主要同事，Yaxin Yao博士和Xiaohui Zhu博士主要负责文库制备和NICS再生测序。贾佳琳博士和我完成了胚胎学工作和样本采集。

刘教授是本课题组的组长。她也是本文的通讯作者。首先，准备试剂和工具。

使用前预热并平衡 20 至 30 微升培养基和透明质酸酶。然后将培养基和透明质酸酶放在通风橱的工作表面上。在培养皿中快速转移消化的OCCC以进行卵母细胞处理，并在每个孔中用矿物油覆盖。

轻轻吸出并释放卵母细胞 5 至 10 次，以去除卵母细胞周围残留的颗粒细胞。在其余三个孔中重复此步骤以完全去除颗粒细胞。使用显微镜评估颗粒细胞去除的完整性。

然后进行卵胞浆内单精子注射，也称为ICSI，并将胚胎转移到培养基中。为每个胚胎准备 20 至 30 微升的囊胚培养基微滴。第二天在组织培养皿中用矿物油覆盖胚胎，并在 37 摄氏度、5% 二氧化碳和 5% 氧气下孵育。

将第三天胚胎转移到洗涤微滴中后，使用移液管在三个液滴中轻轻地吸出并释放微滴中的胚胎。然后将胚胎转移到囊胚培养基中。准备洗涤微滴和培养微滴。

在第四天下午，将胚胎转移到预热的培养基微滴中，并用移液管在三个微滴中轻轻洗涤每个胚胎。将每个胚胎转移到独特的预热单微滴培养基中进行样品收集。在冷冻保存之前培养囊胚胚胎。

为了在胚胎冷冻保存之前进行玻璃化，准备培养微滴并将胚胎转移到10至15微升培养基的预热微滴中。并在第五天早上通过移液在三个微滴中轻轻地洗涤每个胚胎。如前所述，将每个胚胎转移到独特的预热单微滴培养基中以进行样品收集。

并在冷冻保存前在37摄氏度和5%二氧化碳下培养囊胚胚胎。接下来，在距离激光束目标点相当远的地方轻轻调整ICM，该激光束聚焦在滋养外胚层的细胞连接处，在滋养外胚层上产生一个小孔，以将液体从胚腔中释放出来。要收集样品，请在室温下解冻试剂盒中的缓冲液并短暂离心。

然后将每个培养胚胎的培养基转移到含有5微升细胞裂解缓冲液的无RNase-DNase的PCR管中。准备试剂和工具。定量后，用培养基将基因组DNA稀释至每微升50皮克的浓度。

充分混合后，将试管以200G短暂离心5秒钟。在微量离心机中离心培养基 30 至 60 秒后，将 10 微升培养基从管底部稀释的阳性对照和新鲜培养基移液到新的 0.2 毫升 PCR 管中。加入一微升MT酶混合物，通过移液充分混合。

然后立即离心两到三秒钟。将PCR管放入预热的混合样品制备站中并运行裂解程序。解冻并混合预库缓冲液后，立即以 200 G 离心 2 至 3 秒，通过将 2 微升文库前酶混合物加入 60 微升文库预库缓冲液中，为文库前反应制备预混液。

充分混合反应并短暂离心。将 60 微升预库反应混合物加入预处理的培养基样品中。通过移液彻底混合后，立即以200G离心2至3秒，将PCR管置于预热的样品制备站中。

运行预库程序并保持在 4 摄氏度。通过将 1.6 微升文库酶混合物加入 60 微升文库缓冲液中，制备用于文库反应的预混液。如前所述，充分混合反应并离心。

向每个预库产物中加入 60 微升的文库反应混合物和 2 微升的条形码引物。然后充分混合反应物并如图所示离心。离心后，将PCR管放入热循环仪中。

运行文库制备程序，然后保持在 4 摄氏度。准备试剂和工具。将制备的 1X 制备的巨型微珠添加到文库样品中。

按照文本手稿中的描述对纯化的文库进行定量，并使用每个文库样品的 10 ng 进行合并。参考测序用户指南，测序完成后进行数据分析。在登录页面输入用户名和密码，以便在ChromGo中进行数据分析。

登录后，单击"NICS"选项卡下的"创建提交"。然后选择NGS作为平台，选择Illumina作为公司，选择NICSInst作为试剂。在"项目 ID"下的框中输入项目信息。设置分析首选项并上传文件。

成功上传所有测序文件后，单击"提交"开始分析。提交的项目列在"查看提交"选项卡下。单击"报告"字段中的"显示"按钮可查看 NICS 分析的汇总表。

单击"导出报告"按钮以保存报告。从患者身上获得六个囊胚，从第四天到第五天培养基对所有六个胚胎进行NICS检测。使用NICS测定法在5条染色体中检测到由父母平衡易位引起的染色体异常，因此不用于转移。

两个胚胎的NICS结果显示，相同的核型45 XN和18号染色体缺失均为18号染色体缺失。染色体一区缺失的核型46 XN短臂仅是染色体区缺失的短臂。NICS结果显示核型为46 XN，18号染色体长臂缺失，1号染色体短臂区域重复。

尽管核型是五条染色体重复并显示出八条镶嵌差异，但 NICS 测定可以筛选所有 24 条染色体的非整倍体。该过程为转移单个正常核型囊胚提供了一种新方法。在尝试此程序时，重要的是要记住完全去除累积细胞以避免母体来源污染，并在 DNA 含量足以扩增时收集培养基和阐述的囊胚阶段。

通过使用NICS技术，本研究在大约3小时内简化了WGA和WGS文库的制备步骤，并在大约9小时内选择了非侵入性CCS结果。开发后，该技术为ART的临床医生提供了一种将形态学评估与NICS相结合的新方法，将具有良好形态的无倍体胚胎移植到子宫中，可能会提高持续妊娠率和活产率。