在转录组学水平上表征基因表达是了解健康和疾病中细胞功能的关键。我们的方法侧重于从人类供体的脑膜动脉中捕获内皮细胞，血管壁的关键层，以单细胞和空间分辨率进行转录组学分析。在没有分选步骤的情况下，血管中存在丰富的内皮细胞群，这可能导致细胞损失。
此外，还存在其他细胞类型，可以研究组织环境中的细胞 - 细胞相互作用。我们已经使用这种技术来研究糖尿病和肥胖症的动脉变化。根据血管的可用性，这些技术也可以重新用于探索其他脉管系统和其他疾病的生物学。
如果是第一次，两个关键步骤需要最多的练习。第一，刮擦，尽管应该施加足够的力来去除整体细胞，而不会分离更深层。第二，低温恒温切片。
确保切片是冷的，平坦的，并且在专用载玻片的范围内。演示该程序的将是罗英军和唐晓芳，他们是我实验室的两位博士后研究员。开始用DPBS清洗纸巾。
用无菌镊子和解剖剪刀，去除脂肪和外部结缔组织，直到血管清洁。用放置在盘子外面的尺子测量容器的长度，并拍摄照片记录。用剪刀纵向切开肠系膜动脉，垂直打开血管腔。
使用针头将容器连接到所有四个角的黑色蜡上，露出内膜。向内膜中加入一毫升预热的消化缓冲液。使用无菌手术刀，轻轻刮擦血管腔两次。
将消化缓冲液转移到管中。向内膜中加入一毫升消化缓冲液，并小心地上下移液以收集剩余的细胞并将细胞悬浮液转移到管中。将细胞在37摄氏度下在培养箱或摇床上孵育五分钟。
将M199培养基加入细胞悬浮液中以淬灭酶促反应并轻轻混合。在离心结束时以四摄氏度和600倍 G.At 将悬浮液离心五分钟，除去并分别储存上清液作为对照培养物，以观察是否所有细胞都被捕获在沉淀中。然后，将细胞沉淀重新悬浮在一毫升M199培养基中。
通过将10微升台盼蓝与10微升细胞原液混合来评估细胞活力。观察细胞形态并使用血细胞计数器计数细胞。通过在室温下将500微升附着试剂移液到孔中30分钟来涂覆六孔板的两个孔。
用无菌DPBS洗涤孔后，将整个细胞储备分配到一个孔中，并将上清液作为对照保持在第二个孔中。将先前制备的细胞浆料在4摄氏度和600倍G下离心5分钟。除去上清液，用P-1000移液管在DPBS中0.04%BSA中轻轻地重新悬浮沉淀。
充分混合以确保单细胞悬浮液。将溶液通过40微米过滤器以去除细胞碎片。然后，离心悬浮液并除去上清液，如图所示。
使用P-1000移液器将沉淀重新悬浮在DPBS中0.04%BSA的500微升中，并充分混合以确保单细胞悬浮液。如前所述，使用台盼蓝评估细胞活力。使用血细胞计数器或自动细胞计数器，观察单细胞悬浮物形态，检查组织碎片，并计算活细胞和死细胞的数量。
将异戊烷加入金属罐后，在液氮或干冰中冷却。将OCT化合物倒入标记塑料冷冻模具的孔中，防止气泡形成。将冷冻霉菌放在干冰上冷却。
在容器的长度上至少切割两个一厘米的日冕部分。使用12英寸镊子，将组织浸没在异戊烷中直至冷冻。将组织快速浸没在OCT中，方向为中心可见的管腔。
抓住冷冻模具并将其放在干冰上，观察冻结情况。OCT将在一到两分钟内从外部逐渐变白。将这些部分存放在零下80摄氏度的安全容器中长达六个月。
为腔室和试样头设置所需的低温恒温器温度。在低温恒温器中将OCT嵌入的血管部分，刀，刷子和滑块平衡至零下20摄氏度约30分钟。在平衡的同时，用70%乙醇清洁机器和所有可能接触这些部分的设备，包括刀片，然后用RNase去污溶液。
通过将少量OCT分配到圆形低温恒温器块上并在样品冻结之前将其放在顶部来附着样品。将块放入试样头的中心后，使用左侧的高黑色手柄将块拧到位。切掉容器周围任何多余的OCT。
在低温恒温器上将切割厚度设置为10微米，切割约60段并将其置于含有RNA提取试剂的预冷1.5毫升管中。涡旋直到各部分完全溶解。按照文本手稿中的描述提取RNA，并将纯化的RNA沉淀溶解在五微升无RNase的水中。
切割10微米厚的切片，防滚板就位。通过轻轻触摸周围的OCT部分来翻转并小心地压平，用乙醇擦拭载玻片，并用手指预热捕获区域的背面。
使用不含RNase的低温恒温刷或直接使用载玻片，仅使用周围的OCT将组织部分放在正方形内，立即将一根手指放在捕获区域的背面，将该部分融化到载玻片上。一旦切片粘附，将载玻片放在冷冻棒上，以使切片冻结。
切割10微米厚的组织切片，如前所述，在组织优化或基因表达载玻片上。将载玻片转移到放置在干冰上的载玻片邮件机上。该图描绘了使用所述方案培养的分离EC，显示出独特的鹅卵石样形态，污染细胞最小。
EC标志物血管内皮钙粘蛋白的表达使用免疫荧光可视化细胞间连接来确认。大约80%的细胞是CD31阳性，表明人类肠系膜动脉EC占新鲜分离细胞群的大部分。不成功的分离导致细胞具有紊乱的形态，可能表达间充质标志物或类似于成纤维细胞状态的伸长。
该图显示了使用本方案对分离的人肠系膜动脉ECS进行单细胞RNA测序的肠系膜动脉分离的代表性均匀流形近似和投影，其中34%的细胞使用PECAM1和VWF作为标记物聚类为EC。高质量的RNA应显示不小于6的RNA完整性数，并且28S与18S核糖体RNA条带的比率应尽可能接近2。当RNA降解时，可以观察到这些核糖体RNA信号的弱或缺失。
苏木精和曙红染色可视化了血管的形态，从而可以识别感兴趣的区域。在苏木精和曙红染色的血管上进行空间锚定，观察基因表达。小心处理组织和细胞储备，以保持RNA质量，特别是对于空间转录组分析。
确保将组织放在干冰上，以减少RNA降解。此外，使用预冷的仪器处理切片和组织。我们已经能够探索EC基因表达变化，包括糖尿病背景下的LncRNA及其与其他细胞类型的相互作用。
我们可以使用空间转录组分析技术推断出这些转录组变化的位置。
