流式细胞术是一种强大的技术，可以对单个细胞进行多参数分析。它可以通过分析数百万个细胞准确快速地识别早期和晚期细胞凋亡的生物标志物。对多个细胞分子进行染色并同时检测。
特别是，台式流式细胞术允许非专业流式细胞仪进行分析和解释。演示该程序的将是来自维生素D癌症组的研究生Esther Zhou。首先在 37 摄氏度和 5% CO 2 的潮湿 CO2 环境中培养细胞培养物。
在传代实验细胞之前，确保细胞培养物在母瓶中汇合约70%。从烧瓶中取出培养基并用1X PBS洗涤细胞。然后加入一毫升胰蛋白酶以分离细胞。
细胞开始分离后，在计数细胞之前，通过添加约5毫升补充有10%胎牛血清的新鲜培养基来中和胰蛋白酶。在六孔细胞培养板中的3毫升细胞培养基中以每毫升15,000个细胞的速度接种细胞。将培养板在 37 摄氏度下用 5% CO 2 孵育过夜，以使细胞附着到孔底部。
第二天，分别用每毫升放线菌素D处理100纳克的实验培养物，并分别用新鲜培养基和DMSO处理培养基和溶剂对照24小时。从孔中取出培养基，并将用过的培养基收集在15毫升管中。用1X PBS洗涤细胞。
加入500微升胰蛋白酶以分离细胞。轻轻地反移一毫升培养基两到三次，以机械方式去除仍然附着在孔底部的剩余细胞。将孔中的溶液加入15毫升管中，然后加入5毫升新鲜培养基以中和胰蛋白酶。
在微量离心管中移取450微升含有DNA结合染料的试剂。向微量离心管中加入50微升细胞悬液。将试管在室温下孵育五分钟。
通过流式细胞术计数细胞。在进行细胞凋亡测定之前，用细胞培养基将所有样品稀释至每毫升10至第六个细胞的浓度。为了使用膜联蛋白V检测磷脂酰丝氨酸的外化，将100微升细胞悬液加入微量离心管中。
为此，加入100微升荧光偶联膜联蛋白V和7-AAD试剂的1：1混合物。在室温下孵育20分钟，避光。为了分析线粒体膜去极化，首先以300倍G离心100微升细胞悬液5分钟，然后弃去上清液。
将细胞重悬于一毫升1X PBS中。向每个样品中加入100微升TMRE染色溶液，并通过轻柔的背移液混合悬浮液。用干净的铝箔包裹样品以保护它们免受光照，并将细胞在 37 摄氏度的潮湿 CO2 环境中孵育 20 分钟。
在孵育结束时，向样品中加入7-AAD工作溶液并混合。为了检测活化的末端半胱天冬酶-3和7，首先将DMSO中DEVE结合的DNA结合肽稀释至1：8的比例与无菌1X PBS的比例，以使半胱天冬酶检测工作溶液。将溶液储存在冰上或加入两到八摄氏度，避光。
将两微升7-AAD储备溶液加入148微升1X PBS中，制成7-AAD工作溶液。将溶液储存在冰上或两到八摄氏度，避光。以300倍G离心50微升细胞悬液5分钟，弃去上清液。
将细胞重悬于50微升1X PBS中，然后加入5微升半胱天冬酶检测工作溶液并充分混合。松开管的盖子，在37摄氏度的加湿CO2环境中孵育30分钟，避光。向每个样品中加入 150 微升 7-AAD 工作溶液并混合。
在室温下孵育五分钟，避光。为了检测双链DNA断裂和总DNA损伤，首先以300倍G离心50微升细胞悬液5分钟，并弃去上清液。将细胞重悬于500微升1X PBS中，并加入500微升甲醛固定缓冲液并混合。
将样品在冰上孵育10分钟。以300倍G离心五分钟，弃去上清液。将细胞重悬于微量离心管中的90微升1X PBS中。
向微量离心管中加入10微升抗体溶液。在室温下在黑暗中孵育30分钟。加入100微升1X PBS，以300倍G离心5分钟，弃去上清液并将细胞重悬于200微升1X PBS中。
在将样品加载到流式细胞仪上之前，通过轻轻的回移液混合样品。通过运行仪器的系统检查套件来验证流式细胞仪的分析性能，并且在完成所有检查并通过之前不要继续运行样品。首先，将阴性对照样品加载到流式细胞仪上，然后选择运行、调整设置，以便仪器开始吸液样品并提供检测到事件的实时预览。
使用实时预览，调整荧光和细胞大小的阈值。在细胞群周围绘制一个矩形门，拖动阈值标记以排除细胞碎片，然后选择下一步，设置细胞凋亡曲线以继续。点击并拖动象限标记以分离细胞群并实时绘制检测到的事件。
使用这些图来指导最终用户正确放置象限标记。选择下一步，验证设置以继续，以便仪器显示设置摘要。查看设置后，选择“下一步”、“完成设置”以将这些设置应用于试验中的所有样本。
通过轻轻回移液混合第一个样品，并将第一个样品加载到流式细胞仪上。选择“下一步”，然后命名示例并选择“运行”，以便系统开始运行示例。如果需要，在采集后对门或象限标记进行微调。
通过导航系统的文件浏览器找到需要调整的实验，然后打开实验。点击绘图的缩略图预览以放大它。要调整象限标记，请单击垂直线和水平线的交点以按原样移动标记，然后通过单击线并拖动手柄来调整任一线的角度。
要优化细胞门控，请单击门选项卡并调整门的尺寸。根据需要调整标记，并通过选择复选标记图标、标记所有样本并选择“接受”，将这些设置应用于实验中的所有样本。一式三份运行测试，并使用事后 Bonferroni 检验运行方差分析，以评估样本和对照之间的显著差异。
细胞计数和活力结果显示，样本中95.2%的细胞是活的，4.8%是死的。发现细胞浓度为每毫升105个细胞的5.90倍。膜联蛋白V和细胞死亡测定显示，与对照组相比，用每毫升放线菌素D处理100纳克的SiHa细胞中的凋亡细胞显着增加。
线粒体电化学跨膜电位测定显示放线菌素-D、培养基对照和溶剂对照之间的细胞健康特征显着降低，这表明每毫升放线菌素 D 100 纳克诱导 SiHa 细胞中的线粒体去极化。与对照相比，半胱天冬酶-3和7测定显示用每毫升放线菌素D处理100纳克的SiHa细胞中末端半胱天冬酶的显着激活。放线菌素 D 显著诱导 DNA 损伤标志物、ATM 和 H2A。
SiHa细胞中的X，这表明DNA损伤显着增加。为了提高准确性，请确保收获总细胞群。此外，请遵守制造商推荐的细胞浓度和染色时间。
保护染色样品免受光照，避免光漂白或荧光团。流式细胞术对细胞凋亡的生化分析应由显微镜支持。这将确定经典细胞凋亡的形态学特征。
特征包括核凝聚、细胞膜混合、凋亡小体和核流。
