使用荧光测定法或流式细胞术测量半胱天冬酶活性

该协议允许研究人员确定半胱天冬酶活性是否与细胞死亡一起发生，从而识别细胞死亡的不同模式。该技术的优点是在基于群体的测定或单细胞中评估半胱天冬酶活性的灵活性。演示该程序的将是博士毕业生Stefanie Rufli和Wendy Wei-Lynn Wong实验室的访问博士生Jing Tong。

按照手稿中所述分化和收获骨髓来源的巨噬细胞或BMDM后，将它们接种在六孔板中，密度为每毫升10至第六个细胞的1倍。用SMAC模拟物处理细胞16小时。为了制备细胞裂解物，将含有处理过的细胞的板转移到冰上，并将细胞培养基收集到1.5毫升管中。

在 300 G 下在 4 摄氏度下离心五分钟。吸出培养基并将管子放在冰上。然后在细胞培养板中加入一毫升冷PBS以洗涤细胞。

吸出所有PBS后，向细胞中加入100微升胰蛋白酶。一旦细胞从板上分离，将它们收集到1.5毫升管中。离心细胞悬液后，除去上清液并将沉淀重悬于100微升DISC裂解缓冲液中。

将样品在冰上孵育20分钟，然后离心裂解物以沉淀不溶性部分。将 25 μL 裂解物转移到白色平底 96 孔板中进行半胱天冬酶-3/7 活性测定，将 10 μL 转移到透明的平底 96 孔板中以进行二辛可宁酸或 BCA 测定。对于蛋白质定量，准备一系列牛血清白蛋白或BSA浓度作为标准蛋白质。

将标准BSA加入到包含样品的平底96孔板后，以50：1的比例混合BCA试剂一和二，并向标准品中的每个样品中加入200微升。在37摄氏度下孵育30分钟后，在荧光仪器上测量562纳米处的吸光度，并用标准曲线定量蛋白质浓度。要进行基于群体的测定，请启动荧光仪器并将机器加热至 30 摄氏度。

将激发和发射波长分别设置为 360 和 465 纳米。然后按照手稿中的说明在冰上制备主反应混合物，以确定半胱天冬酶活性。向每个样品和标准品中加入75微升混合物，以获得100微升的总反应体积。

使用荧光仪器设置立即测量荧光，并在 40 分钟内每分钟记录单个读数以确定反应动力学。接种后，将先前演示的贴壁细胞收获到五毫升聚苯乙烯管中。然后将样品在4摄氏度下以300 G离心5分钟，并除去上清液。

为了制备染色混合物，取一微升荧光底物并用150微升PBS稀释。每个样品加入 50 微升染色混合物，在 37 摄氏度的黑暗中孵育 30 分钟，每 15 分钟混合一次。在这种基于群体的测定中，半胱天冬酶-3/7活性的动力学测定的代表性数据显示底物切割随着SMAC模拟浓度的增加而增加。

然而，基于具有多重比较的普通单因素方差分析，500纳摩尔浓度下的增加并不显着。使用流式细胞术分析半胱天冬酶-3/7活性表明，与未处理的细胞相比，用SMAC模拟物处理的细胞的荧光发生了变化，这在绘制的中位荧光强度中也很明显，并且在500纳摩尔浓度下增加是显着的。该程序应在冰上进行。

然而，在基于群体的测定中，样品不能无限期地留在冰上。裂解步骤后，应立即对样品进行进一步处理或冷冻。使用活细胞显微镜对半胱天冬酶活性进行成像将是获得单细胞水平动力学信息的另一种方法。