凋亡逆转细胞真实种群的分离以前一直是个问题，这极大地限制了我们对凋亡逆转后果的理解。该协议允许我们生成更纯净的凋亡逆转细胞群。该技术的主要优点是，所用材料和设备在不同的机构中广泛提供。
这种技术很容易适用于隔离经过细胞凋亡逆转的更纯净的细胞群。如前所述，正常细胞也可以进行凋亡逆转，除了乳腺癌细胞，可以启动不同的化疗细胞，以及正常细胞，并可以使用各种凋亡刺激。由于逆转细胞经历了凋亡和快速分拣，恢复率通常较低。
一个更大的起始细胞号是重组，以提高最终产量。首先，培养MCF-7、MDA-MB-231、开始培养MCF-7、MDA-MB-231和T47D细胞，根据文本协议。在此之后，用PBS清洗细胞两次，然后将两毫升0.05%的三辛-EDTA的0.05%的尝试辛-EDTA添加到MCF-7， 和MDA-MB-231细胞，到MCF-7和MDA-MB-231细胞，以及两毫升0.25%的尝试素-EDTA和两毫升0.25%的三辛-EDTA到T47D细胞。
到 T47D 单元格。在37摄氏度的温度下培养细胞5分钟，在5%的二氧化碳细胞培养箱中培养细胞。当细胞孵育时，用显微镜检查细胞的分离，防止通过三辛-EDTA过度消化。
当超过 90% 的细胞分离时，在培养皿中加入五毫升已完成的 RPMI 介质，并在细胞层表面移液几次。然后，将细胞转移到15毫升锥形管和离心机。丢弃上流水剂，并在 1.5 毫升微离心管中用 FACS 缓冲液重新悬浮颗粒。
然后，将细胞分成几个管。再次离心管，并丢弃上流水。然后，将稀释的 Fc 块添加到样品中。
在黑暗中将样品孵育20分钟，然后再将样品离心。在此之后，丢弃上经剂。接下来，在1至40和1至10个稀释组中，分别添加针对人类CD44和CD24的氟铬结合单克隆抗体和CD24。
对于阳性对等，添加CD44抗体 对于阳性对等，将CD44抗体加入MDA-MB-231细胞，加入MDA-MB-231细胞，将CD24抗体加入MCF-7细胞，将CD24抗体加入MCF-7细胞，在1至40个细胞中加入CD24抗体，将CD24抗体添加到MCF-7细胞中，在1至40个细胞中加入CD24抗体，将CD24抗体添加到MCF-7细胞中，在1至40个细胞中加入CD24抗体，将CD24抗体添加到MCF-7细胞中，在1至40个细胞中加入MCF-7细胞，将CD24抗体添加到MCF-7细胞中，在1至40个细胞中加入1至10个稀释。添加 PerCP-Cy5.5 小鼠 IgG2b Kappa，添加 PerCP-Cy5.5 小鼠 IgG2b Kappa，以 1 比 40 的比例稀释细胞，作为 CD44 抗体的同位素对照。然后，加入PE小鼠IgG2a Kappa，然后，加入PE小鼠IgG2a卡帕，以1比10的比例稀释细胞作为CD24抗体的同位素对照。
在黑暗中在4摄氏度下孵育样品30分钟。然后，将样品在300克离心，然后在300克和4摄氏度下将样品离心5分钟。丢弃上一杯，在500微升PBS中清洗颗粒两次。
然后，重复前文所述的离心。将颗粒重新悬浮在 0.5 毫升 PBS 上，并通过 40 微米尼龙网过滤悬浮液。然后，通过荧光激活的细胞分拣机运行悬浮液。
收集具有 CD44 阴性细胞和 CD24 正标记的细胞，在包含一毫升收集介质的圆底管中。然后，离心管，并丢弃上流水。接下来，在含有新鲜收集介质的培养皿中，将已排序的乳房非干细胞进行盘，以进一步培养。
首先，在DMSO中使用一毫摩尔孢子素，根据文本协议，在介质中准备2.5微摩尔孢子素。然后，从单元格中删除培养培养。用两毫升PBS洗涤细胞一次，在此之后，将10毫升的葡萄球菌介质加入MSF-7细胞6小时，当细胞汇合70%时诱导凋亡。
接下来，在 DMSO 中准备一毫摩尔帕利塔塞尔。然后，加入12.5微升然后，加入1毫摩尔帕利塔塞尔的12.5微升到T47D细胞的完成介质，以组成15毫升圆锥管10毫升的最终体积。从细胞中去除培养培养，用2毫升PBS清洗细胞。
然后，将paclitaxel介质加入细胞10小时，诱导凋亡10小时，当细胞达到70%汇合时诱导凋亡。在此之后，从经溶剂处理的MCF-7组取出介质，用两毫升PBS洗涤。然后，加入10毫升0.25%的DMSO介质，然后，加入10毫升0.25%的DMSO介质6小时作为对葡萄球菌的溶剂控制。
从经过溶剂处理的T47D组中去除培养基，用两毫升PBS清洗细胞。然后，加入10毫升0.05%的DMSO介质，然后，加入10毫升0.05%的DMSO介质10小时作为帕利塔塞尔的溶剂控制。接下来，在37摄氏度的二氧化碳培养箱中染色细胞，在37摄氏度下孵育20分钟。
使用 60 倍共声激光扫描显微镜观察处理后细胞的形态变化。将凋亡诱导剂和经过溶剂处理的 MCF-7 和 T47D 细胞以及经过溶剂处理的 MCF-7 和 T47D 细胞在黑暗中染色 30 分钟，在 5% 的二氧化碳培养箱中达到 37 摄氏度。使用荧光激活细胞分拣机，从含有一毫升收集介质的圆形底部管中诱导治疗的组收集阳性细胞。
然后，如前面所述，将管离心，并丢弃上流液。用一毫升的收集介质从溶剂处理组收集负细胞。离离管，然后丢弃上流液。
在此之后，重新挂起新收集介质中的排序单元格。在12孔组织培养板中播种细胞，培养细胞7天，进行凋亡逆转。用0.05%的三辛-EDTA在诱导剂和溶剂处理组中收获反向MCF-7。
与0.05%的尝试素-EDTA。然后，在两种诱导剂中收获T47D细胞，然后用0.25%的三辛-EDTA在诱导剂和溶剂处理组中收获T47D细胞。用氟铬结合的单克隆抗体对人CD44和CD24染色细胞。
当细胞染色时，准备等值控制，如先前所证明的。最后，在流动细胞仪上运行细胞，检测具有 CD44 阳性和 CD24 负标记的细胞的百分比。在该协议中，观察到从乳腺非干细胞到乳腺CSC样细胞的过渡。
非干细胞的分离首先在MCF-7细胞中完成。在加入凋亡诱导剂后观察到典型的形态变化，在药物戒断后从具有类似形态的凋亡中恢复细胞。与没有caspace激活的细胞不同，caspace激活的细胞根据其高荧光强度进行标记和排序。
在凋亡诱导过程中，溶剂被用来排除事实程序或溶剂本身是过渡原因的可能性。在凋亡诱导治疗组中，发现细胞是内新五阳性和PI阴性，表明它们是凋亡细胞。凋亡细胞被收集和培养进行恢复，与经过溶剂处理的组相比，流动细胞测量分析表明，在逆转的原乳腺非干细胞群体中，CD44阳性和CD24阴性象限中出现细胞。
在流量分析和细胞分拣中，加量非常重要，在实验室中应准备足够的控制。由于这种体外凋亡逆转程序分离纯凋亡癌细胞，因此可以进行体内肿瘤生成资产等实验，以了解真正逆转细胞的后果。这项技术揭示了癌症复发的原因，因此，可以研究，有可能防止癌症患者的再次发生。
请记得在根据您机构的生物安全层规定进行细胞培养实验时妥善保护自己。
