基于毛细管电泳的氢/氘交换，用于自上而下的质谱法对蛋白质进行构象表征

该方法允许在单个CEMS测量中完成共存蛋白质物种的分离，包括不同的构象或变体，并在线表征其高阶结构差异。它利用电泳效应为HDX反应和HDX期间共存蛋白质物种的正交分离提供近100%持续时间的环境，以进行自上而下的MS分析。从毛细管电泳的预处理，氢氘交换或CE HDX设置开始。

在50%甲醇，49%水和1%甲酸的混合物中超声处理，在室温下清洁通过微样品CE-MS界面的流动至少30分钟。将 HPC 改良毛细管安装在毛细管电泳或 CE 仪器上。使用自动进样器用背景电解质溶液或BGE冲洗毛细管10分钟，并使其充满BGE。

使用适当长度的未改性二氧化硅毛细管作为改性剂溶液的输注管。使用活接和适当的套管将改性剂管连接到具有钝温度的气密玻璃注射器，并使用输液泵用改性剂溶液冲洗管子至少10分钟。将装有相应溶液的 HPC 编码 CE 毛细管和改性剂管的出口插入清洁的 CE-MS 接口。

使用输液泵推进注射器，使改性剂溶液到达接口的尖端。将组装好的CE-MS接口安装在质谱仪的纳米电子喷雾电离源外壳上。向 CE-MS 接口施加 3-5 千伏的喷雾电压。

将改性剂溶液与注入器泵一起以每分钟0.1-10微升的流速注入，并确保在CE-MS接口的尖端进行稳定的电喷雾。放置含有BGE和自动采样器的样品瓶，稍后将用于获取空白电泳图和空白质谱。使用注射量和注射参数之间的关系估计注射量。

并使用自动进样器以两个PSI进样样品溶液，持续适当的持续时间。通过在0-2 PSI范围内的输注压力下施加20千伏的电泳电压来开始CE分离，并获得电泳图。同时，在色谱模式下获取MS数据，其中离子电流图作为时间的函数获取，并且相应的MS扫描不会自动组合成单个光谱。

保存空白电泳图和质谱作为参考。将含有所需浓度蛋白质样品溶液的样品瓶置于自动进样器中，并获取电泳分离和氘标记蛋白质物种的电泳图和MS1光谱。对感兴趣的物种执行串联 Ms.测量，在同一运行中获取 MS1 光谱后，或在随后的单独运行中。

每次测量后，用BGE在20 PSI的压力下冲洗毛细管至少10分钟。在实验完成后，清洁CEMS接口和所有管道以进行存储。在直接输注模式下使用 MS 获取 HDX 端点样本的数据集。

低输注压力导致CE峰的分离更好，但导致迁移时间和实验持续时间的增加。较长的 HDX 反应时间导致蛋白质分析物的去累水平较高。β免疫球蛋白或β-IG的A和B方差，其序列中仅存在两个氨基酸残基的差异，在EIC衍生的电泳图中产生了两个充分分离的峰。

差异的氘标记方差导致离子的质量分布不同。Z离子的相对丰度低于C离子，因为在确认βIG时存在独特的异构连接，这限制了CS 82和CS 176之间的碎片化效率。β IGA产生的大多数片段离子和β IGB表现出相似程度的氘摄取。

然而，覆盖β IGA序列变异位点的较大片段的贬值程度明显高于β IGB。BGE的pH值根据样品的等电点进行调整，以防止蛋白质聚集，并在保持复合物的同时促进分离。