Этот метод позволяет разделить сосуществующие виды белка, включая различные конформеры или варианты, и онлайн-характеристику их различий в структуре более высокого порядка, которые должны быть завершены в одном измерении CEMS. Он использует электрофоретический эффект, чтобы обеспечить почти 100% продолжительность среды для реакций HDX и ортогонального разделения сосуществующих белковых форм во время HDX для анализа РС сверху вниз. Начните с предварительного кондиционирования капиллярного электрофореза, водородного дейтериевого обмена или установки CE HDX.
Используя ультразвук в смеси 50% метанола, 49% воды и 1% муравьиной кислоты, очищают поток через микроволиальный интерфейс CE-MS в течение не менее 30 минут при комнатной температуре. Установите модифицированный капилляр HPC на капиллярный электроферез или инструмент CE. Промыть капилляр фоновым раствором электролита или БГЭ в течение 10 минут с помощью автопробоотборника и оставить его заполненным БГЭ.
Используйте подходящую длину немодифицированной плавленой капиллярной трубки кремнезема в качестве инфузионной трубки для раствора модификатора. Используйте соединение и соответствующую втулку для подключения трубки модификатора к газонепроницаемому стеклянному шприцу с тупой температурой и промывайте трубку раствором модификатора в течение не менее 10 минут с помощью инфузионного насоса. Вставьте в очищенный интерфейс CE-MS выпускные отверстия капиллярной и модификаторной трубки HPC, загруженные соответствующими решениями.
Выдвигайте шприц с помощью инфузионных насосов таким образом, чтобы раствор модификатора достигал кончика интерфейса. Установите собранный интерфейс CE-MS на корпус источника ионизации наноэлектронного распыления масс-спектрометра. Нанесите напряжение распыления 3-5 киловольт на интерфейс CE-MS.
Настаивайте раствор модификатора с инфузионным насосом со скоростью потока от 0,1-10 микролитров в минуту и обеспечьте стабильное электрораспыление на кончике интерфейса CE-MS. Поместите флакон с образцом, содержащий BGE и автоматический пробоотборник, который будет использоваться позже для получения пустых электроферограмм и пустых масс-спектров. Оцените объем впрыска, используя соотношение между объемом впрыска и параметрами впрыска.
И вводите образец раствора с помощью автоматического пробоотборника при двух PSI в течение соответствующего периода времени. Начните разделение СЕ с подачи электрофоретического напряжения 20 киловольт в давлении инфузии в диапазоне от 0-2 фунтов на квадратный дюйм и получите электроферограмму. Между тем, получение данных МС в хроматографическом режиме, где график ионного тока получается в зависимости от времени, а соответствующие сканирования МС не объединяются автоматически в единый спектр.
Сохраните пустую электроферограмму и масс-спектры в качестве ссылок. Поместите флаконы с образцами, содержащие желаемые концентрации растворов образца белка, в автопробоотборник и получите электроферограммы и спектры MS1 электрофоретически разделенных и меченых дейтером белковых видов. Выполняйте тандемные измерения Ms.для интересующих видов либо после приобретения спектров MS1 в рамках того же прогона, либо в последующем отдельном прогоне.
После каждого измерения промывайте капилляр БГЭ при давлении 20 фунтов на квадратный дюйм в течение не менее 10 минут. Очистите интерфейс CEMS и все трубки для хранения после завершения экспериментов. Получение набора данных образца конечной точки HDX с помощью MS в режиме прямой инфузии.
Низкое инфузионное давление привело к лучшему разделению пиков CE, но привело к увеличению как времени миграции, так и продолжительности эксперимента. Более длительное время реакции HDX привело к более высокому уровню дедурации белковых аналитов. Дисперсия А и В бета-иммуноглобулина или бета-IG, которые отличаются только двумя аминокислотными остатками в их последовательности, привели к появлению двух адекватно разделенных пиков в электроферограмме, полученной из EIC.
Дифференциальная дисперсия, меченая дейтерием, привела к отчетливому массовому распределению ионов. Наблюдалось более низкое число в относительном изобилии ионов Z, чем ионов C, из-за уникальной дисофированной связи в подтверждении бета-IG, которая ограничивает эффективность фрагментации между CS 82 и CS 176. Большинство фрагментов ионов, полученных из бета-IGA и бета-IGB, демонстрируют одинаковую степень поглощения дейтерия.
Однако более крупные сегменты, охватывающие участки вариации последовательностей из бета-IGA, были дедурированы в значительно большей степени, чем бета-IGB. pH BGE регулируется в соответствии с изоэлектрической точкой образца, чтобы предотвратить агрегацию белка и облегчить разделение при сохранении комплекса.
