تسمح هذه الطريقة بفصل أنواع البروتين المتعايشة ، بما في ذلك المطابقات أو المتغيرات المختلفة والتوصيف عبر الإنترنت لاختلافات هيكلها الأعلى ترتيبا ليتم إكمالها في قياس CEMS واحد. وهو يستخدم التأثير الكهربائي لتوفير بيئة مدتها 100٪ تقريبا لتفاعلات HDX والفصل المتعامد لأنواع البروتين المتعايشة أثناء HDX لتحليل MS من أعلى إلى أسفل. ابدأ بالتكييف المسبق للرحلان الكهربائي الشعري أو تبادل الديوتيريوم الهيدروجيني أو إعداد CE HDX.
باستخدام الموجات فوق الصوتية في خليط من 50٪ ميثانول و 49٪ ماء و 1٪ حمض الفورميك ، قم بتنظيف التدفق من خلال واجهة CE-MS الدقيقة لمدة 30 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. قم بتركيب الشعيرات الدموية المعدلة HPC على أداة الكهربية الشعرية أو أداة CE. شطف الشعيرات الدموية بمحلول إلكتروليت الخلفية أو BGE لمدة 10 دقائق باستخدام جهاز أخذ العينات التلقائي واتركه ممتلئا ب BGE.
استخدم طولا مناسبا من أنابيب الشعيرات الدموية غير المنصهرة غير المعدلة كأنابيب ضخ لمحلول المعدل. استخدم اتحادا وأكماما مناسبة لتوصيل أنبوب المعدل بحقنة زجاجية محكمة الإغلاق تعمل بالغاز مع درجة حرارة حادة وشطف الأنابيب بمحلول المعدل لمدة 10 دقائق على الأقل باستخدام مضخة تسريب. أدخل منافذ أنابيب CE الشعرية والمعدلة المشفرة من HPC المحملة بالحلول المقابلة في واجهة CE-MS التي تم تنظيفها.
تقدم المحقنة باستخدام مضخات التسريب بحيث يصل محلول المعدل إلى طرف الواجهة. قم بتركيب واجهة CE-MS المجمعة على مصدر تأين رذاذ الإلكترون النانوي لمقياس الطيف الكتلي. قم بتطبيق جهد رذاذ من 3-5 كيلوفولت على واجهة CE-MS.
قم ببث محلول المعدل مع مضخة المنقوع بمعدل تدفق يتراوح بين 0.1-10 ميكرولتر في الدقيقة وتأكد من وجود رذاذ كهربائي مستقر عند طرف واجهة CE-MS. ضع قارورة العينة التي تحتوي على BGE وجهاز أخذ العينات التلقائي ، والتي سيتم استخدامها لاحقا للحصول على الكهروفيروجات الكهربائية الفارغة وأطياف الكتلة الفارغة. تقدير حجم الحقن باستخدام العلاقة بين حجم الحقن ومعلمات الحقن.
وحقن محلول العينة باستخدام جهاز أخذ العينات التلقائي في اثنين من PSI لمدة مناسبة. ابدأ فصل CE عن طريق تطبيق جهد كهربائي يبلغ 20 كيلوفولت في ضغط تسريب يتراوح من 0-2 رطل لكل بوصة مربعة والحصول على مخطط كهربائي. وفي الوقت نفسه ، احصل على بيانات MS في الوضع الكروماتوغرافي حيث يتم الحصول على الرسم البياني للتيار الأيوني كدالة للوقت ولا يتم دمج عمليات مسح MS المقابلة تلقائيا في طيف واحد.
احفظ مخطط الفيروغرام الكهربائي الفارغ وأطياف الكتلة كمراجع. ضع قوارير العينة التي تحتوي على التركيزات المطلوبة من محاليل عينات البروتين في جهاز أخذ العينات التلقائي واحصل على أطياف الكهربية و MS1 لأنواع البروتين المنفصلة كهربائيا والديوتيريوم. قم بإجراء قياسات Ms.Measurements جنبا إلى جنب للأنواع ذات الأهمية ، إما بعد الحصول على أطياف MS1 داخل نفس التشغيل أو في تشغيل منفصل لاحق.
بعد كل قياس، اغسل الشعيرات الدموية باستخدام BGE عند ضغط 20 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 10 دقائق على الأقل. تنظيف واجهة CEMS وجميع الأنابيب للتخزين عند الانتهاء من التجارب. احصل على مجموعة بيانات من عينة نقطة نهاية HDX باستخدام MS في وضع التسريب المباشر.
أدى انخفاض ضغط التسريب إلى فصل أفضل لقمم CE ، ولكنه أدى إلى زيادة في كل من وقت الهجرة ومدة التجربة. أدى وقت تفاعل HDX الأطول إلى مستوى أعلى من انخفاض مدة تحليلات البروتين. أدى التباين A و B في الغلوبولين المناعي بيتا أو بيتا IG ، اللذان يختلفان باثنين فقط من بقايا الأحماض الأمينية في تسلسلهما ، إلى ظهور قمتين منفصلتين بشكل كاف في مخطط الكهربية المشتق من EIC.
أدى التباين التفاضلي المسمى بالديوتيريوم إلى توزيع كتلة متميزة للأيونات. وقد لوحظ وجود عدد أقل في الوفرة النسبية لأيونات Z من أيونات C بسبب الارتباط الفريد غير المستقر في تأكيد بيتا IG الذي يحد من كفاءة التجزئة بين CS 82 و CS 176. تظهر معظم أيونات الشظايا المنتجة من بيتا IGA ، وبيتا IGB مدى مماثل من امتصاص الديوتيريوم.
ومع ذلك ، تم تخفيض الأجزاء الأكبر التي تغطي مواقع تباين التسلسل من بيتا IGA إلى حد أكبر بكثير من بيتا IGB. يتم ضبط الرقم الهيدروجيني ل BGE وفقا للنقطة المتساوية الكهربية للعينة لمنع تراكم البروتين وتسهيل الفصل مع الحفاظ على المجمع.
