多活性猪猪Bac转座酶介导的秋粘虫，蜉蝣属果蝇蛆中的种系转化

该协议显示了使用基于piggyBac的转化系统生产转基因秋粘虫。我们希望这些方法将有利于改善转化，不仅在秋粘虫中，而且在鳞翅目昆虫中。这里描述的方法使鳞翅目害虫昆虫的种系转化效率很高。

演示该程序的将是我实验室的博士后研究员Xien Chen博士。首先将12只雄性蛹和12只雌性蛹放在一个盒子里。将10%蔗糖溶液放入盒子中喂养成人。

用纸巾盖住盒子。在闭合后的第二天，将成虫暴露在强光下过夜。在关闭后的第三天，将成年人转移到黑暗的地方。

在过度放置后两小时内收集胚胎。在纸巾上加入一滴水，将新鲜鸡蛋放在冰上的培养皿中。用细刷子将鸡蛋轻轻地转移到载玻片上，并在载玻片上逐个对齐。

在显微注射之前，保持载玻片，将鸡蛋放在冰上。使用自动显微注射器的补偿压力，将每微升200纳克小猪Bac表达质粒，每微升200纳克超活性猪Bac转座酶mRNA和无菌蒸馏水的混合物注入鸡蛋中。将注射的卵保持在27加或零下1摄氏度，60±10%相对湿度，直到孵化。

用人工饲料喂养孵化的幼虫，并在早期凝乳和星形阶段将每个幼虫转移到一个小杯子中。收集蛹，并将大约150只雌性和150只雄性蛹放在笼子里。在笼子里挂几条30厘米×15厘米大小的纸巾，以收集鸡蛋。

每天收集带有鸡蛋的纸巾，并将鸡蛋保持在适当的条件下直到孵化。将新生儿幼虫保持在四摄氏度下五分钟以使其固定，然后将其转移到冰冷的盘子上。在荧光体视显微镜下对固定的新生儿幼虫进行筛查。

选择EGFP阳性的新生儿，在大约两周内以27摄氏度或零下一摄氏度将其提升到蛹阶段。使用1%琼脂糖凝胶检测体外合成的过度活跃的piggyBac转座酶mRNA。PDS注射的胚胎没有显示EGFP信号，而表达EGFP的质粒和过度活跃的piggyBac转座酶mRNA注射的胚胎显示出EGP荧光，表明piggyBac构建是成功的。

从G0成虫自交产生的卵中获得的G1幼虫显示出强烈的EGFP信号。使用从EGFP阳性幼虫中分离的基因组DNA作为模板，成功扩增了含有启动子和EGFP片段的片段。然而，当从野生型幼虫中分离出基因组DNA作为模板时，没有检测到相同的片段。

用于显微注射的卵子应尽可能新鲜，并且在显微注射之前必须始终保持在冰上以减缓其发育。该技术为研究人员回答害虫功能基因组学中的问题并为这种全球害虫开发遗传控制方法铺平了道路。