蛋白质 - 蛋白质相互作用的研究提供了对许多生物过程调节的理解。在这里，我们演示了Y John shoe and co描述的初始程序。2007年，作者使用BiFC与FRET组合来验证三种蛋白质分子之间的三方相互作用。
然而，我们在此程序中包括荧光寿命测量，以证实FRET测量。为了证明三方相互作用，我们选择了一种已知同源二聚化的蛋白质。此外，它还经过内部验证，可与该方案中称为C蛋白的蛋白质钙传感器相互作用。
MNC蛋白在细胞质中相互作用。在该技术中，两种蛋白质被标记为分裂的YFP蛋白。它们的相互作用导致作为FRET受体的功能性YFP恢复到第三个相互作用的伴侣，该伴侣被标记为CFP作为FRET供体。
首先通过PCR扩增目标基因的编码序列，这些基因是我们的例子中的M和C基因，并将其克隆到适当的入口载体中。通过限制性酶切和DNA测序验证在含有平板的抗生素上选择的克隆。将重组的 CDS 从入口克隆转移到目标载体。
本实验中使用的所有载体均列于表一。最后，通过电穿孔将农杆菌GV3101细胞与目标载体进行转化。在这里，我们种植了Nicotiana Benthamiana植物，在生长室的受控条件下，仍然有四到六个离开阶段。
通过以2:1:1的比例混合土晶，椰子泥炭和堆肥来制备土壤混合物。在塑料托盘中铺上一英寸厚的这种混合物层，制成土床并用少量水浸透。在土壤上撒上大约200颗种子，然后将其转移到一个更大的托盘中，大约一厘米的积水。
用保鲜膜盖住此托盘以形成防潮室。将此托盘转移到设置在23摄氏度的生长室中，具有16小时的光照和8小时的黑暗循环。两周后，将幼苗转移到含有水饱和土壤混合物的三到四英寸的小花盆中。
将这些花盆放在塑料托盘中，然后将它们转移到生长室中再生长四周。对于农用过滤，细菌菌株需要新鲜亚培养并以适当的比例与P19农药菌株混合。通过接种含有10ml条纹板的BiFC和FRET构建物的GV3101农杆菌菌株来开始该过程。
到含有适当抗生素的肉汤。同时，还要启动P19农杆菌菌株的培养，添加该菌株以防止转基因沉默。用铝箔盖住烧瓶，并将它们放在培养箱振荡器中，将其设置为28摄氏度，转速为170 RPM，持续16小时。
过夜生长后，使用分光光度计将这些培养物的1ml转移到一次性肘部以测量600纳米处的光密度。混合含有菌株的适当BiFC和FRET伴侣的培养物，使最终OD为0.5，P19的OD为0.3，总体积为2ml。
为了达到这些比率，我们按照屏幕上显示的公式进行这些计算。在室温下将混合的农杆菌培养物以3000G离心五分钟，并小心地丢弃上清液。将颗粒悬浮在2毫升中。
浸润缓冲液。您可能需要使用涡流混合器将细胞完全悬浮在均质细胞悬浮液中。之后，将管子在室温下在黑暗中孵育三个小时。
同时，在每个花盆上贴上要渗透的混合物的标签。用农用细菌混合物填充1ml无针注射器。
轻轻但牢固地将注射器尖端压到完全膨胀的叶子的轴侧，同时从另一侧支撑叶子。轻轻推动柱塞，直到溶液在叶片区域中充满，相当于注射器尖端的两到三倍。将细菌混合物浸润在一片叶子上最多四个斑点处，并重复此过程，以获得三到四片叶子以进行一种浸润。
此外，每个构造至少包括两个用于渗透的植物。记得用70%的酒精擦拭双手或更换手套，以防止任何交叉污染。将所有花盆转移到托盘中，并在相同的生长条件下在生长室中孵育。
使用荧光显微镜检查农业渗透叶片的一小部分。当来自YFP和CFP的荧光在细胞中可检测到时，进入共聚焦显微镜进行BiFC FRET-FLIM测定。在我们的案例中，该分析是在农业渗透后三天进行的。
现在，植物已经准备好在显微镜下可视化，将方形叶样品从注射器尖端伤口处切出5至8毫米，然后将其安装在蒸馏水上。将干净的盖子滑过并密封。
在共聚焦激光扫描显微镜中可视化这些样品。在该过程中，确定和量化两种蛋白质之间相互作用的基础是FRET供体伴侣与受体相互作用时荧光寿命的缩短，这用于计算FRET的效率。三方相互作用情况下的复杂性进一步增加，因为在这种情况下，FRET受体不是单个分子，而是分裂的YFP BiFC对，它应该首先在体内重建，成为功能性FRET受体荧光团。
为了进行FRET-FLIM，我们必须确定供体分子的荧光寿命，首先是单独使用，然后在FRET伴侣在场的情况下。在共聚焦激光扫描显微镜中打开FLIM应用程序，启动控制台并使用模式识别光子计数来测量荧光寿命。选择标准的全光子计数测量模式。
我们将采用两种类型的农业渗透植物。一个具有CCFP基因，另一个具有CCFP和MYFP，因为M蛋白的相互作用已经使用BiFC和Y2H与C蛋白进行了验证，我们期望这种相互作用对具有良好的FRET效率。现在，我们首先扫描CCFP农浸润叶片，寻找显示出良好CFP荧光的细胞。
显微镜设置显示在屏幕上。样品以足够的激光功率照射，以达到每脉冲约0.1光子。对于具有可变荧光强度的样品，我们将捕获50帧以收集生命周期测量所需的足够光子。
由于已知CFP由于其确认适应性而表现出两个荧光寿命，因此我们使用指数重卷积模型提供数据，同时保持N的值等于2。在这些设置下，两个生存期在 1 秒和 3.2 纳秒时可见。我们将对所有后续计算使用更高的生存期。
我们现在准备测量CCFP和MYFP之间的FRET。为此，让我们使用来自具有CCFP和MYFP的农业渗透植物的叶片样本。我们寻找一种同时表达CCFP和MYFP的电池，并通过使用全40纳米脉冲激光器和514纳米白光激光器激发它们来确认它们各自的发射模式。
之后，我们切换到 FLIM 控制台，使用与之前用于测量 CCFP 寿命的相同设置来测量 CFP 的生存期。但这一次，细胞也表达了MYFP，这可能与CCFP相互作用，并导致CCFP寿命缩短。正如我们已经阅读了使用N指数再卷积模型获得的图，其中N等于2，实际上CFP寿命从3.2减少到2.6纳秒。
现在，我们在软件中启动 FRET 控制台，通过在软件提供的等式中手动输入无可置疑的寿命来计算 FRET 效率，观察到的 FRET 效率为 56%，现在让我们进入最后一步，即可视化三个合作伙伴之间的交互。为此，我们从与CCFP和MYFPN与MYFPC共同浸润的植物中取出叶子样本。我们扫描叶片植物的细胞，该细胞显示CFP和重组的YFP荧光从两个M蛋白之间的相互作用中发出。
我们使用与之前相同的激光和发射波长。随后，我们关闭了514纳米激光器并移至FLIM控制台。如果 MYFP 二聚体与 CCFP 相互作用。
我们应该看到CCFP的寿命缩短，正如在与MYFP相互作用期间观察到的那样。然而，如果CCFP未能与MYFP二聚体相互作用，其荧光寿命应保持在3.2纳秒。使用上面提到的类似设置，我们在存在重组的YFP的情况下测量CFP寿命。
我们使用等于 2 的 N 指数重卷模型拟合图，然后移动到 FRET 控制台。是的，CFP寿命从3.2纳秒下降到2.3纳秒。我们如上所述计算 FRET 效率。
计算出的FRET效率为55%，在这里我们使用FLIM来测量FRET供体伴侣在存在和不存在FRET受体的情况下的荧光寿命。如果两种蛋白质之间存在正相互作用，则预计供体的荧光寿命会缩短。在阳性对照的情况下，即CCFP和MYFP。
我们观察到供体的荧光寿命从3.3减少到2.5纳秒，FRET效率为56%由于两个单体和C蛋白之间的相互作用而导致的重组YFP的类似运动也导致了积极的FRET相互作用，导致供体的荧光寿命减少到2.6纳秒。在这种情况下，计算出的FRET效率约为55%。FRET供体荧光寿命的缩短为这些蛋白质之间的三方相互作用提供了强有力的证据。
这里描述的方案是确定活细胞中三方蛋白质 - 蛋白质相互作用的强大工具。该过程还可以帮助确定所得复合物的细胞内定位，这对于破译任何蛋白质复合物的功能和生理意义非常重要。总之，基于BiFC的FRET-FLIM测定为研究和表征三方蛋白质相互作用的重要方面提供了机会，这可能有助于动物和植物系统中的蛋白质 - 蛋白质相互作用研究。
