O estudo das interações proteína-proteína proporciona uma compreensão da regulação de muitos processos biológicos. Aqui demonstramos um procedimento descrito inicial por Y John sapato e co. Trabalhadores em 2007, onde os autores usaram o BiFC em combinação com o FRET para validar a interação tripartite entre três moléculas de proteínas.
No entanto, incluímos medidas de vida de fluorescência neste procedimento para comprovar as medidas de FRET. Para demonstrar uma interação tripartite, escolhemos uma proteína, que é conhecida por homodimerizar. Além disso, também foi validado internamente para interagir com um sensor de cálcio de proteína referido como proteína C neste protocolo.
As proteínas MNC interagem no citoplasma. Nesta técnica, duas proteínas são marcadas com proteínas YFP divididas. Sua interação resulta na restituição do YFP funcional que atua como um aceitador de FRET para o terceiro parceiro interagindo, que é marcado com CFP atuando como um doador de FRET.
Comece com a amplificação das sequências de codificação dos genes de interesse que são genes M e C em nosso caso pelo PCR e clone-os em vetores de entrada apropriados. Validar clones selecionados nos antibióticos que contêm placas por digestão de restrição e sequenciamento de DNA. Mobilize os clones de entrada do CDS reconstituídos para os vetores de destino.
Todos os vetores usados neste experimento estão listados na tabela um. Por fim, transforme as células agrobacterium GV3101 com os vetores de destino por eletroporação. Aqui cultivamos as plantas Nicotiana Benthamiana ainda de quatro a seis etapas de licença em condições controladas em uma câmara de cultivo.
Prepare a mistura do solo misturando solo, turfa de coco e adubo em uma proporção de 2:1:1. Espalhe uma camada de uma polegada de espessura desta mistura em uma bandeja de plástico para fazer o leito do solo e satura-lo com um pouco de água. Polvilhe cerca de 200 sementes em cima do solo e transfira para uma bandeja maior que cerca de um centímetro de água parada.
Cubra esta bandeja com plástico para criar uma câmara de umidade. Transfira esta bandeja para uma câmara de cultivo a 23 graus centígrados com 16 horas de luz e ciclo escuro de oito horas. Após duas semanas, transfira as mudas jovens para pequenos vasos de três a quatro polegadas contendo mistura de solo saturado de água.
Coloque esses potes em uma bandeja de plástico e transfira-os para cultivar câmara por mais quatro semanas. Para a agroinfiltração, as cepas bacterianas precisam ser recém-subculturadas e misturadas juntamente com a cepa P19 de agrobacterium em proporções apropriadas. Inicie este procedimento inoculando cepas de agrobacterium GV3101 contendo construções BiFC e FRET a partir de placas de raia em 10 ml.
ao caldo contendo antibióticos apropriados. Paralelamente, também iniciamos uma cultura de cepa P19 de agrobactérias, que é adicionada para evitar o silenciamento transgene. Cubra o frasco com papel alumínio e mantenha-o em um agitador de incubadora, coloque-o 28 graus centígrados a 170 RPM por 16 horas.
Após a transferência de crescimento durante a noite 1 ml. dessas culturas para um cubit descartável para medir a densidade óptica em 600 nanômetros usando um espectrofotômetro. Misture as culturas do parceiro BiFC e FRET apropriados contendo cepas para que o OD final seja 0,5 E o de P19 seja 0,3 em um volume total de 2 ml.
Para alcançar essas proporções seguimos a fórmula mostrada na tela para esses cálculos. Centrifugar as culturas de agrobacterium mistas a 3000G por cinco minutos à temperatura ambiente e descartar cuidadosamente o sobrenatário. Suspenda as pelotas em 2 ml.
tampão de infiltração. Você pode ter que usar um misturador de vórtice para re-suspender as células em uma suspensão celular homogênea completamente. Depois disso, incubar os tubos à temperatura ambiente no escuro por três horas.
Enquanto isso, rotule cada vaso de planta para a mistura de construção com a sua vez. Encha uma seringa sem agulha de 1 ml com a mistura agrobacteriana.
Pressione suavemente, mas firmemente, a ponta da seringa para o lado abaxial de uma folha totalmente expandida enquanto suporta a folha do outro lado. Empurre suavemente o êmbolo até que a solução se encha na área da folha equivalente a duas a três vezes a ponta da seringa. Infiltrar a mistura bacteriana em até quatro pontos em uma folha e repetir este procedimento para três a quatro folhas para um tipo de infiltração.
Além disso, inclua pelo menos duas plantas por construção para infiltração. Lembre-se de limpar as mãos com 70% de álcool ou trocar as luvas para evitar qualquer contaminação cruzada. Transfira todos os potes para uma bandeja e incubar na câmara de crescimento na mesma condição de crescimento.
Verifique uma pequena parte da folha agroinfiltada usando um microscópio de fluorescência. Quando a fluorescência de YFP e CFP são detectáveis em células proceder ao microscópio confocal para o ensaio BiFC FRET-FLIM. No nosso caso, essa análise foi realizada três dias após a agroinfiltração.
Agora que as plantas estão prontas para serem visualizadas sob um microscópio corte amostras de folhas quadradas de cinco a 8 mm. longe da ferida da ponta da seringa e montá-las em água destilada. Coloque uma tampa limpa sobre ele e selado.
Visualize essas amostras no microscópio de varredura a laser confocal. Neste procedimento, a base de determinação e quantificação da interação entre duas proteínas é a redução da vida fluorescência do parceiro doador DA FRET após sua interação com o aceitador, que é utilizado para calcular a eficiência do FRET. A complexidade no caso da interação tripartite aumenta ainda mais porque o aceitador da FRET neste caso não é uma única molécula, mas um par YFP BiFC dividido, que deve primeiro ser reconstituído in vivo para se tornar um fluoróforo iscotado funcional.
Para realizar o FRET-FLIM, temos que determinar a fluorescência das moléculas doadoras ao longo da vida, primeiro sozinhas e depois na presença de um parceiro FRET. Abra o aplicativo FLIM no microscópio de varredura a laser confocal, inicie o console e use a contagem de fótons de reconhecimento de padrão para medir a vida útil da fluorescência. Selecione o padrão todo o modo de medição de contagem de fótons.
Vamos levar dois tipos de plantas agroinfiladas. Um que tenha o gene CCFP e o outro que tenha CCFP junto com MYFP porque a interação da proteína M já foi validada com a proteína C usando BiFC e Y2H, esperamos boa eficiência de FRET com esse par de interação. Agora primeiro escaneamos a folha agroinfiltada CCFP e procuramos por uma célula mostrando boa fluorescência cfp.
As configurações do microscópio são mostradas na tela. A amostra é iluminada a potência laser suficiente para alcançar aproximadamente 0,1 fótons por pulso. Para amostras com intensidade variável de fluorescência, capturaremos 50 quadros para coletar fótons adequados necessários para a medição vitalícia.
Como o PCP é conhecido por exibir duas vidas de fluorescência devido à sua adaptação confirmacional, alimentamos os dados usando um modelo de reconvolução exponencial, mantendo o valor de N igual a dois. Nessas configurações, as duas vidas são visíveis em um e 3,2 nanossegundos. Usaremos a vida útil mais alta para todos os cálculos subsequentes.
Estamos agora definidos para medir fret entre CCFP e MYFP. Para isso vamos usar a amostra de folha da planta agroinfiltada com CCFP e MYFP. Procuramos uma célula que expresse tanto o CCFP quanto o MYFP e confirmemos seus respectivos padrões de emissão, excitando-os usando laser de pulso de 40 nanômetros completo e laser de luz branca de 514 nanômetros.
Depois disso, mudamos para o console FLIM para medir a vida útil do CFP usando as mesmas configurações que usamos anteriormente para medir a vida útil do CCFP. Mas desta vez a célula também está expressando MYFP que pode potencialmente interagir com o CCFP e causar uma redução na vida útil do CCFP. Como lemos o gráfico obtido usando o modelo de reconvolução exponencial N com N igual a dois, há de fato uma diminuição na vida útil do PCP de 3,2 para 2,6 nanossegundos.
Agora iniciamos o console FRET no software e calculamos a eficiência do FRET inserindo manualmente a vida útil inquestionável na equação fornecida no software e a eficiência observada do FRET é de 56%Agora vamos passar para a etapa final, que é visualizar a interação entre três parceiros. Para isso, pegamos a amostra de folha de uma planta que foi co-infiltrada com CCFP e MYFPN com MYFPC. Escaneamos a planta de folhas para uma célula que mostra tanto a fluorescência YFP reconstituída emanando da interação entre duas proteínas M.
Usamos o mesmo comprimento de onda de laser e emissão usado anteriormente. Posteriormente, desligamos o laser de 514 nanômetros e nos movemos para o console FLIM. Se o dimer MYFP interagir com o CCFP.
Devemos ver uma redução na vida útil do CCFP como observado durante sua interação com o MYFP. No entanto, se o CCFP não interagir com o dimer MYFP, sua vida útil de fluorescência deve permanecer vista em 3,2 nanossegundos. Utilizando as configurações semelhantes às mencionadas acima, medimos a vida útil do CFP na presença de YFP reconstituído.
Encaixamos o gráfico usando o modelo de reconvolução exponencial N com um igual a dois e movemos para o console FRET. E sim, há um declínio na vida útil do CFP de 3,2 para 2,3 nanossegundos. Calculamos a eficiência do FRET como descrito acima.
A eficiência calculada do FRET é de 55%Aqui usamos o FLIM para medir a vida útil da fluorescência do parceiro doador FRET na presença e ausência do aceitor da FRET. Esperava-se uma redução na vida de fluorescência do doador se houvesse uma interação positiva entre as duas proteínas. Em caso de controle positivo, ou seja, CCFP e MYFP.
Observamos uma redução na vida útil da fluorescência do doador de 3,3 para 2,5 nanossegundos e a eficiência do FRET foi de 56%Um exercício semelhante com YFP reconstituído resultou da interação entre dois amonomers e proteínas C também resultou em uma interação positiva de FRET levando à redução da vida útil da fluorescência do doador para 2,6 nanossegundos. A eficiência calculada do FRET foi de cerca de 55% neste caso. A redução da vida fluorescência do doador DE FRET fornece uma forte evidência para uma interação tripartite entre essas proteínas.
O protocolo descrito aqui é uma ferramenta poderosa para determinar interações tripartites proteína-proteína em células vivas. Este procedimento também pode ajudar a determinar a localização intracelular dos complexos resultantes, o que é importante na decifração da função e da significância fisiológica de qualquer complexo proteico. Em conclusão, o ensaio FRET-FLIM baseado em BiFC oferece uma oportunidade de estudar e caracterizar aspectos importantes das interações proteicas tripartites, que podem ser úteis em estudos de interação proteína-proteína em sistemas animais e vegetais.
