توفر دراسة التفاعلات البروتينية البروتينية فهما لتنظيم العديد من العمليات البيولوجية. هنا نحن نثبت إجراء وصفها الأولي من قبل Y جون الأحذية وشركاه. العمال في عام 2007، حيث استخدم المؤلفون BiFC بالاشتراك مع FRET للتحقق من التفاعل الثلاثي بين ثلاثة جزيئات بروتين.
ومع ذلك، قمنا بتضمين قياسات العمر الفلوري في هذا الإجراء لإثبات قياسات FRET. ولإظهار تفاعل ثلاثي، اخترنا بروتينا معروفا بالتجانس. وعلاوة على ذلك، فقد تم التحقق من صحتها أيضا في المنزل للتفاعل مع جهاز استشعار الكالسيوم من البروتين المشار إليها باسم بروتين C في هذا البروتوكول.
تتفاعل بروتينات MNC في السيتوبلازم. في هذه التقنية، يتم وضع علامة اثنين من البروتينات مع البروتينات YFP الانقسام. يؤدي تفاعلها إلى رد YFP الوظيفية التي تعمل كمقبل FRET إلى الشريك التفاعل الثالث ، والتي يتم وضع علامة عليها مع CFP بوصفها المانح FRET.
ابدأ بتضخيم تسلسلات الترميز للجينات ذات الاهتمام التي هي جينات M و C في حالتنا بواسطة PCR واستنساخها في ناقلات الدخول المناسبة. التحقق من صحة المستنسخات التي يتم تحديدها على المضادات الحيوية التي تحتوي على لوحات عن طريق تقييد الهضم وتسلسل الحمض النووي. تعبئة CDS'from استنساخ الإدخال المعاد تشكيله إلى متجهات الوجهة.
جميع المتجهات المستخدمة في هذه التجربة مدرجة في الجدول الأول. وأخيرا، تحويل الخلايا GV3101 البكتيريا الزراعية مع ناقلات الوجهة عن طريق الكهرومporation. هنا نزرع نباتات نيكوتيانا بنثاميانا لا تزال أربعة إلى ستة مرحلة إجازة في ظروف خاضعة للرقابة في غرفة النمو.
إعداد مزيج التربة عن طريق خلط التربة، كوكو الخث والسماد في نسبة 2:1:1. نشر طبقة سميكة بوصة واحدة من هذا المزيج في صينية بلاستيكية لجعل سرير التربة وتشبع مع القليل من الماء. رش حوالي 200 بذور على رأس التربة ونقلها إلى صينية أكبر أن حوالي سنتيمتر واحد من المياه الراكدة.
تغطية هذه الدرج مع غلاف بلاستيكي لإنشاء غرفة الرطوبة. نقل هذه الدرجة إلى غرفة تنمو تعيين في 23 درجة مئوية مع ضوء 16 ساعة ودورة مظلمة لمدة ثماني ساعات. بعد أسبوعين نقل الشتلات الشباب إلى الأواني الصغيرة 3-4 بوصة تحتوي على مزيج التربة المشبعة بالماء.
ضع هذه الأواني في صواني بلاستيكية ونقلها لتنمو الغرفة لمدة أربعة أسابيع أخرى. بالنسبة للترشيح الزراعي ، تحتاج السلالات البكتيرية إلى أن تكون طازجة شبه مثقفة ومختلطة جنبا إلى جنب مع سلالة P19 من البكتيريا الزراعية بنسب مناسبة. ابدأ هذا الإجراء عن طريق تلقيح سلالات البكتيريا الزراعية GV3101 التي تحتوي على بي إف سي و FRET من لوحات متتالية في 10 مل.
إلى مرق تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة. جنبا إلى جنب، أيضا بدء ثقافة سلالة P19 من البكتيريا الزراعية، والتي تضاف لمنع إسكات المتحولين جنسيا. تغطية القارورة مع رقائق الألومنيوم والاحتفاظ بها في شاكر حاضنة، تعيينها 28 درجة مئوية في 170 دورة في الدقيقة لمدة 16 ساعة.
بعد نقل النمو بين عشية وضحاها 1 مل من هذه الثقافات إلى تكعيبية المتاح لقياس الكثافة البصرية في 600 نانومتر باستخدام مطياف. مزيج ثقافات مناسبة BiFC و FRET شريك يحتوي على سلالات بحيث OD النهائي هو 0.5 وذلك من P19 هو 0.3 في حجم إجمالي قدره 2 مل.
لتحقيق هذه النسب نتبع الصيغة المعروضة على الشاشة لهذه الحسابات. الطرد المركزي الثقافات الزراعية المختلطة في 3000G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة وتجاهل بعناية supernatant. تعليق الكريات في 2 مل.
حاجز التسلل. قد تضطر إلى استخدام خلاط دوامة لإعادة تعليق الخلايا في تعليق الخلية متجانسة تماما. بعد هذا احتضان الأنابيب في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة ثلاث ساعات.
وفي الوقت نفسه، تسمية كل وعاء النبات لخليط بناء انها ستعمل يكون تسللت مع. ملء حقنة 1 مل. إبرة مع مزيج البكتيريا الزراعية.
بلطف ولكن بحزم اضغط على طرف حقنة إلى الجانب abaxial من ورقة موسعة تماما في حين دعم ورقة من الجانب الآخر. ادفع المكبس برفق حتى يملأ المحلول في مساحة الورقة ما يعادل مرتين إلى ثلاث مرات كما هو الحال في طرف الحقنة. التسلل إلى المزيج البكتيري في ما يصل إلى أربعة بقع على ورقة واحدة وتكرار هذا الإجراء لمدة ثلاث إلى أربع أوراق لنوع واحد من التسلل.
أيضا، وتشمل ما لا يقل عن اثنين من النباتات لكل بناء للتسلل. تذكر أن تمسح يديك ب 70٪ كحول أو تغير قفازاتك لمنع أي تلوث متقاطع. نقل جميع الأواني إلى صينية واحتضان في غرفة النمو في نفس حالة النمو.
تحقق من جزء صغير من ورقة agroinfiltrated باستخدام المجهر الفلوري. عندما تكون الفلورية من كل من YFP وCFP قابلة للكشف في الخلايا المضي قدما إلى المجهر confocal ل BIFC FRET-FLIM المقايسة. في حالتنا، تم إجراء هذا التحليل بعد ثلاثة أيام من الترشيح الزراعي.
الآن أن النباتات على استعداد لتصور تحت المجهر قطع عينات ورقة مربعة من خمسة إلى 8 ملم بعيدا عن الجرح طرف حقنة وجبل لهم على الماء المقطر. ضع غطاء نظيفا فوقها وختم.
تصور هذه العينات في المجهر المسح بالليزر confocal. في هذا الإجراء، أساس تحديد وقياس التفاعل بين اثنين من البروتينات هو الحد من العمر الفلوري للشريك المانح FRET عند تفاعله مع المقبول، والذي يستخدم لحساب كفاءة FRET. التعقيد في حالة التفاعل الثلاثي يزيد أكثر لأن FRET acceptor في هذه الحالة ليس جزيء واحد ، ولكن زوج YFP BiFC المنقسم ، والذي يجب أولا إعادة تشكيله في الجسم الحي ليصبح متقبلا وظيفيا ل FRET fluorophore.
لتنفيذ FRET-FLIM، علينا أن نحدد مدى الحياة الجزيئات المانحة مضان، أولا وحدها ومن ثم في وجود شريك FRET. افتح تطبيق FLIM في مجهر المسح بالليزر البؤري، وابدأ وحدة التحكم واستخدم عد فوتون التعرف على الأنماط لقياس عمر الفلورسينس. حدد وضع قياس عد جميع فوتونات القياسية.
سنأخذ نوعين من النباتات الزراعية المصفاة. واحد يحتوي على جين CCFP والآخر يحتوي على CCFP جنبا إلى جنب مع MYFP لأن التفاعل من بروتين M قد تم التحقق من صحته بالفعل مع بروتين C باستخدام BiFC و Y2H ، نتوقع كفاءة جيدة FRET مع هذا الزوج المتفاعل. الآن نحن أول مسح ورقة CCFP agroinfiltrated والبحث عن خلية تظهر مضان CFP جيدة.
يتم عرض إعدادات المجهر على الشاشة. يتم إضاءة العينة بقوة ليزر كافية لتحقيق ما يقرب من 0.1 فوتون لكل نبضة. بالنسبة للعينات ذات كثافة الفلورية المتغيرة، سنقوم بالتقاط 50 إطارا لجمع الفوتونات الكافية اللازمة لقياس مدى الحياة.
كما هو معروف CFP لعرض اثنين من العمر الفلورية بسبب التكيف التأكيدي، ونحن تغذية البيانات باستخدام نموذج إعادة تعقيدا الأسي مع الحفاظ على قيمة N يساوي اثنين. في هذه الإعدادات، تكون عمران مرئيتين في واحد و 3.2 نانو ثانية. سوف نستخدم عمر أعلى لجميع الحسابات اللاحقة.
نحن الآن على استعداد لقياس FRET بين CCFP و MYFP. لهذا دعونا استخدام عينة ورقة من مصنع agroinfiltrated مع CCFP و MYFP. نحن نبحث عن الخلية التي تعبر عن كل من CCFP و MYFP وتأكيد أنماط الانبعاثات الخاصة بهم من خلال إثارة لهم باستخدام كامل 40 نانومتر نبض الليزر و 514 نانومتر ليزر الضوء الأبيض.
بعد ذلك ننتقل إلى وحدة تحكم FLIM لقياس عمر CFP باستخدام نفس الإعدادات التي استخدمناها سابقا لقياس عمر CCFP. ولكن هذه المرة الخلية هو أيضا التعبير عن MYFP التي يمكن أن تتفاعل مع CCFP وتسبب انخفاضا في عمر CCFP. كما قرأنا الرسم البياني الذي تم الحصول عليه باستخدام نموذج إعادة تعقيدا N الأسي مع N يساوي اثنين ، هناك في الواقع انخفاض في عمر CFP من 3.2 إلى 2.6 نانو ثانية.
نبدأ الآن وحدة التحكم FRET في البرنامج وحساب كفاءة FRET عن طريق إدخال يدويا مدى الحياة لا يرقى إليه الشك في المعادلة المقدمة في البرنامج والكفاءة FRET لوحظ هو 56٪ الآن دعونا ننتقل إلى الخطوة النهائية، وهذا هو تصور التفاعل بين ثلاثة شركاء. لهذا، ونحن نأخذ عينة ورقة من النبات الذي كان تسللت مع CCFP و MYFPN مع MYFPC. نحن مسح نبات ورقة لخلية الذي يظهر كل من CFP وإعادة تشكيلها YFP الفلورسينس المنبثقة من التفاعل بين اثنين من البروتينات M.
نحن نستخدم نفس الطول الموجي الليزر والانبعاثات كما استخدمت في وقت سابق. في وقت لاحق، ونحن إيقاف الليزر 514 نانومتر والانتقال إلى وحدة التحكم FLIM. إذا كان DIMER MYFP يتفاعل مع CCFP.
وينبغي أن نرى انخفاضا في عمر CCFP كما لوحظ خلال تفاعلها مع MYFP. ومع ذلك ، إذا فشل CCFP في التفاعل مع جهاز MYFP dimer ، فيجب أن يظل عمر الفلورسينس الخاص به عند 3.2 نانو ثانية. باستخدام إعدادات مماثلة كما ذكر أعلاه، ونحن قياس مدى الحياة CFP في وجود YFP المعاد تشكيلها.
نحن تناسب الرسم البياني باستخدام نموذج N إعادة تعقيدا أسي مع يساوي اثنين والانتقال إلى وحدة التحكم FRET. ونعم هناك انخفاض في عمر CFP من 3.2 إلى 2.3 نانو ثانية. نحن حساب كفاءة FRET كما هو موضح أعلاه.
كفاءة FRET المحسوبة هي 55٪ هنا استخدمنا FLIM لقياس عمر الفلورية للشريك المانح FRET في وجود وغياب مقبول FRET. وكان من المتوقع حدوث انخفاض في عمر المتبرع الفلوري إذا كان هناك تفاعل إيجابي بين البروتينين. في حالة وجود سيطرة إيجابية ، وهذا هو CCFP و MYFP.
نلاحظ انخفاضا في عمر الفلورية للمتبرع من 3.3 إلى 2.5 نانو ثانية وكانت كفاءة FRET 56٪ وأسفرت عملية مماثلة مع YFP المعاد تشكيلها عن التفاعل بين اثنين من الأمونوميرات والبروتينات C أيضا عن تفاعل إيجابي FRET مما أدى إلى انخفاض عمر المضان للمتبرع إلى 2.6 نانو ثانية. وكانت كفاءة FRET المحسوبة حوالي 55٪ في هذه الحالة. انخفاض العمر الفلوري للمتبرع FRET يوفر دليلا قويا على التفاعل الثلاثي بين هذه البروتينات.
البروتوكول الموصوف هنا هو أداة قوية لتحديد التفاعلات الثلاثية بين البروتين والبروتين في الخلايا الحية. يمكن أن يساعد هذا الإجراء أيضا في تحديد التعريب داخل الخلايا للمجمعات الناتجة ، وهو أمر مهم في فك شفرة الوظيفة والأهمية الفسيولوجية لأي مجمع بروتين. في الختام، يوفر اختبار FRET-FLIM القائم على BIFC فرصة لدراسة وتوصيف الجوانب الهامة من التفاعلات الثلاثية للبروتين، والتي يمكن أن تكون مفيدة في دراسات التفاعل بين البروتين والبروتين في كل من النظم الحيوانية والنباتية.
