对成年 冈比亚按蚊 的有效口服RNA干扰（RNAi）给药

RNA干扰是用于蚊子逆转遗传学的主要工具之一，口服递送使我们能够诱导和维持成年蚊子的基因沉默，而无需微量注射。将双链RNA口服递送到成年蚊子是一种低成本和多功能的RNA干扰方法，可显着减少研究基因功能的工作量，时间和工作量。这种方法不仅可以用于研究冈比亚按蚊中的其他靶基因，还可以用于研究另一个感兴趣的按蚊，如白化按蚊。

首先，从含有双链RNA的大肠杆菌菌株HT115（DE3）的单个细菌菌落中培养培养物，该培养物在含有氨苄西林和四环素的5毫升lb中，在平台振荡器上以37摄氏度和180 RPM的速度生长12小时。12小时后，取0.5毫升过夜生长的细菌培养物，并在含有氨苄西林和四环素的2X酵母胰蛋白培养基中制成1000分之一的稀释液。为了诱导双链RNA的产生，在40微摩尔的最终浓度下加入IPDG。

然后将培养物在如图所示的振荡条件下孵育两小时。在孵育结束时，当培养物的光密度在600纳米处达到0.4时，通过在4， 000倍G下在4摄氏度下浓缩细菌细胞10分钟，然后将细胞在一体积的PBS中洗涤。再次旋转细胞后，将细胞重悬于PBS中并在70摄氏度下孵育一小时。

加热杀死细菌后，制作400微升体积的等分试样，并将其储存在20摄氏度直至进一步使用。将一个400微升等分试样表达双链RNA的解冻热杀灭细菌与1.6毫升含有0.2%对羟基苯甲酸甲酯的12%糖溶液混合。将一个小棉球浸泡在该溶液中，并将其放入装有五天大蚊子的笼子中，并确保蚊子以该溶液为食。

连续八天更换浸泡在双链RNA糖溶液中的棉球，确保笼子在恒定条件下保持。要用冷麻醉蚊子，将容器放在冰上，直到蚊子停止移动，然后将蚊子放在寒冷的表面上，隔离雌性进行解剖。用乙醇喷洒蚊子后，将它们放在装有PBS的玻璃表面上。

用一对镊子固定蚊子头并非常缓慢地拉动胸部，使唾液腺释放到PBS中。一旦从10只蚊子中解剖唾液腺，拉动腺体进行RNA提取。完成RNA提取后，将RNA沉淀悬浮在30微升RNA游离水中。

测量吸光度并计算RNA浓度，如文本手稿中所述。使用商业逆转录试剂盒，从一微克RNA合成cDNA。根据制造商的建议，将cDNA稀释10次，并一式三份地设置靶基因和管家基因的RTPCR反应。

使用标准实时荧光定量 PCR 条件扩增 CDNA。为了评估血液喂养的能力，将15只雌性蚊子放在小笼子里，用靶标和受控的双链RNA处理，并将它们饿死四个小时。使用设置为37摄氏度的循环水浴，玻璃蚊子喂食器和peryfill膜向蚊子提供除颤的廉价血液。

观察，计数和记录从前五名女性中成功获得血粉的探测尝试次数，以便在每组中完全充血。在分离新鲜组织和PBS之前已经证明后，将其固定在冰冷的丙酮中90秒。然后在PBS中冲洗组织几次，并与一抗抗体在四摄氏度下孵育过夜，抗血清在PBS中稀释。

在孵育结束时，用PBS洗涤组织几次。加入在PBS中稀释的荧光二抗，并在室温下在黑暗中孵育两小时。在两小时孵育结束前30分钟加入任何反污渍。

两小时后，用PBS洗涤组织三次，然后将组织安装在100%甘油中，放在标准显微镜载玻片上，并带有一毫米厚的盖玻片，并储存在20摄氏度下直到成像。微阿雷表达数据显示，所有选择的靶基因在成体唾液腺中的表达，AAPP和鼠尾草的水平特别高。双链RNA有效地降低了唾液腺中叉头转录本的丰度。

叉头双链RNA喂养蚊子表现出比对照组或FEG双性双链RNA喂养蚊子完全充血的五倍。与蚂蚁对照RNA干扰相比，叉头RNA干扰后所有唾液腺叶的鼠尾草和CrebA染色水平显着降低。当考虑高度丰富的唾液成分蛋白时，与对照RNA干扰处理相比，叉头RNA干扰后所有三个唾液腺叶的AAPP水平均降低。

另一方面，没有观察到粘蛋白水平的变化。这些数据表明，叉头对不同唾液蛋白基因的表达有不同的贡献。前叉头RNA干扰处理后，远端侧叶观察到Rab11荧光降低，但内侧和近端侧叶中也发生了Rab11信号增加。

与对照RNA干扰处理相比，叉头RNA干扰后尼罗河红信号未观察到明显差异。一些秘书机器反应以复杂的方式在唾液腺叶之间有所不同。该技术可以使研究人员沉默可以通过单次注射双链RNA来减少表达的基因，并探索双链RNA的口服递送以使用RNAi作为潜在的载体控制方法。