Yapay besleme ve tükürük toplama, böcek tükürüğündeki efektörleri tespit etmek için doğrudan bir yöntem sağlar. Ancak, bu daha önce ayrıntılı olarak açıklanmamıştır. Bu protokol saprofitik böceklerden tükürük toplanması için etkilidir.
Ek olarak, yapay bir diyet olarak sadece sakkaroz içeren ortam kullandığımız için basit bir tekniktir. Saprofitik böceklerin tükürüğü, beslenme davranışına fayda sağlamak ve patojenleri iletmek için konağın bağışıklık sistemine karşı etkileyebilir. Böcek davranışı ve böcek kemik yolu araştırması için kullanılabilecek bu ilaç.
Bu, gerçekleştirilmesi gereken basit bir yöntemdir. Bununla birlikte, bu, daha fazla araştırma için tükürük toplandığı için temiz deneysel ortamın montajını göstermektedir. Yapay diyet için% 5 sakkaroz çözeltisi hazırlayarak başlayın ve bakteriyel kontaminasyonu ve safsızlıkları gidermek için çözeltiyi 0.22 mikron filtreden filtreleyin.
Yaklaşık 200 küçük kahverengi bitki hunisi larvasını bir beslenme odasına sokmadan önce üç ila beş saat boyunca aç bırakın. Daha sonra, cam silindirleri besleme odaları olarak hazırlamak için, deneysel böcekleri tanıtmadan önce odanın bir açık ucunu bir parafin zarı ile örtün, ardından böcekleri cam silindire aktarın ve odanın diğer ucunu gerilmiş parafin zarı ile örtün. Membran üzerine 200 mikrolitre yapay diyet ekleyin, ardından sıvıyı başka bir gerilmiş parafin zarı tabakası ile örtün.
Son olarak, odayı alüminyum folyo ile örtün ve ucu ışığa maruz kalan yapay diyet cihazı ile bırakın. 24 saat sonra, böcekleri hareketsiz hale getirmek için silindiri dört santigrat derecede soğutarak SBPH tükürüğü toplayın, ardından dış filmi ortaya çıkarın ve yapay diyeti steril bir pipet kullanarak 1,5 mililitre steril tüpler halinde toplayın. Toplanan tükürüğü analize kadar eksi 80 santigrat derecede tutun.
Daha sonra, iç zarı 50 mikrolitre taze yapay diyetle üç kez yumuşak bir şekilde pipetle çalkalayarak durulayın ve yapay yıkama diyetini 1,5 mililitre steril tüpler halinde toplayın. Üç durulamadan sonra, iç zara taze yapay diyet ekleyin ve üzerine taze gerilmiş bir parafin zarı yerleştirin. Son olarak, toplanan örnekleri mikropları ve diğer kirleticileri gidermek için 0,22 mikron filtre ünitesinden filtreleyin.
Toplu tükürük örneklerini 500 mikrolitre, 10 kilodalton santrifüj filtreye aktarın. Örneği santrifüjle. Süpernatantı toplayın ve son hacmi 100 mikrolitreye getirin.
Toplanan tükürüğün konsantrasyonunu ölçmek için UV görünür spektrofotometreyi açın ve kaideleri çift damıtılmış suyla üç kez yıkayın. Ekrandaki seçenekleri aşağıdaki sırayla seçin, proteinler, protein A280. Mililitre başına bir miligrama eşit tip ve bir absorbans ünitesi seçin.
Ardından temel düzeltme, 340 nanometre için kutuyu işaretleyin. Ardından, %5 sakkaroz sulu çözeltiden oluşan iki mikrolitreyi boş olarak yükleyin, ardından ekranın altındaki Boş'a dokunun. Son olarak, standartları belirledikten sonra, toplanan tükürüğün iki mikrolitresini yükleyin ve protein konsantrasyonu kaydedin.
% 5 sakkarozla beslenirken, SBPH'nin% 80'inden fazlası ilk dört gün hayatta kaldı. Bununla birlikte, beşinci günden itibaren mortalite hızla% 40'a yükseldi ve yedinci günde SBPH'nin yarısından azı hayatta kaldı. Bir SDS sayfa analizi, RSV ile enfekte SBPH tükürüğünden alınan konsantre tükürük örneklerinin% 5 sakkaroz negatif kontrolünden çok daha fazla protein içerdiğini göstermiştir.
Enfekte olmayan ve virülifer böcekler olan RSV kapsid proteininin tespiti için batılı bir blot analizinde. RSV kapsid proteini virülifer numunesinde başarıyla tespit edildi, LssgMP gen ürününe karşı tasarlanmış bir antikor, enfekte olmayan ve virülifer örneklerde 78 kilodalton protein tespit etti ve LssgMP'nin tükürük proteini olduğunu gösterdi. Farklı dokulardaki LssgMP transkript seviyelerinin QRT PCR analizi, tükürük bezinde Lssg transkript seviyelerinin tüm vücuttan ve bağırsaktan 20 kat daha yüksek olduğunu ve tükürük bezinde LssgMP'nin spesifik ifadesini doğruladığını göstermiştir.
Deneysel böcekleri odaya sokmadan önce aç bırakmak, tükürük koleksiyonumuzun verimliliğini sağlamak için gereklidir. Ayrıca, toplanan numunedeki mikrobiyal kontaminasyonu azaltmak için her 24 saatte bir yapay bir ortam toplanmalı ve değiştirilmelidir. Bu teknik, patojenlerin iletiminde tükürüğün işlevini incelemek için doğrudan bir yöntem sağlar.
Ek olarak, böcek patojen konak etkileşimi çalışmaya yardımcı olabilir.
