通过共聚焦显微镜成像分析进行细胞外囊泡摄取测定

该协议为在细胞水平上分析EV提供了一种强大的方法，并为有效的EV摄取和EV跟踪分析提供了一种实用的方法。这种EV标记方法消除了EV和染料的共沉淀，从而增强了EV信号。通过体积分析来测量EV的吸收，以区分内化的EV和浅表的EV。

电动汽车是活跃的货物，因此，它们的吸收允许生化分子的转移。对于基于EV的药物递送和癌症治疗的研究，该技术可以成为评估工具。EV摄取在细胞间通讯中发挥作用，并在各种研究领域进行研究，例如癌症生物学，神经科学和药物递送。

该协议可能有助于有效的EV摄取测定。为了分离细胞外囊泡或EV，将一毫升预处理的细胞培养基注入基于纳滤的微流体装置的样品室中。要操作设备，请在台式纺纱机中以 3000 RPM 旋转设备 10 分钟。

纺丝后，通过移液或吸气从废物室中除去液体，然后重复此过程两次以处理另外两毫升的细胞培养基。接下来，要清洗隔离的EV，将一毫升PBS注入样品室，然后在台式纺纱机中旋转设备。对于EV的免疫荧光标记，将每毫升EV特异性抗体注射一微克到含有100微升分离EV的装置的洗脱孔中。

然后在黑暗中在平板振荡器上孵育一小时，以确保抗体在样品上的均匀分布。接下来，将胶带粘附在洗脱孔上。将一毫升PBS注入样品室以洗出残留抗体，然后旋转设备直到样品室空无一人。

通过将另一毫升PBS注入样品室并旋转设备（如前所述）来重复洗涤。从腔室中除去残留液体后，将膜室中荧光标记的EV移液到琥珀色管或微型管中。在使用前保护管子免受光照。

用一毫升培养基将4次10至第四个PC3细胞接种到35毫升培养皿中。让细胞在最佳细胞培养条件下粘附过夜。第二天，用外泌体耗尽的培养基洗涤粘附的细胞两次。

使用外泌体耗尽的培养基将荧光标记的EV稀释至适当的浓度后，将稀释的EV加入粘附的靶细胞中并孵育所需的实验时间。通过用无外泌体培养基洗涤细胞三次去除非内化EV后，用每毫升CMTMR一微克标记粘附细胞的细胞质，并在最佳细胞培养条件下孵育。对于活细胞成像，将制备的细胞置于舞台培养箱中。

根据对照样品设置成像参数后，确定目标细胞的深度和Z方向上的堆叠大小范围以获取3D共聚焦图像，然后将图像采集设置为同时具有细胞特异性染料和EV特异性染料的多个Z堆叠图像。对于图像处理，请使用自动图像处理软件。要构建单元格的虚拟曲面，请单击"添加新曲面"。

要配置虚拟像元表面，请单击添加按钮，然后选择质量作为过滤器类型。通过目视检查阈值下限的适当值，设置上限的最大值，然后单击"完成"按钮 接下来，要构建EV的虚拟点，请单击按钮添加新点。在"算法设置"下，选择"不同光斑大小"和"最短距离计算"，然后单击"下一步"并选择通道 1 Alexa Fluor 488 作为源通道。

在"点检测"下输入估计 XY 直径的适当值，然后单击下一步。要配置虚拟 EV 点，请单击添加按钮，然后选择质量作为过滤器类型。通过目视检查设置阈值下限，然后单击下一步 对于点区域类型，选择绝对强度，然后单击下一步。

要对 EV 点的区域设置阈值，请为"通过目视检查的区域阈值"输入适当的值。在"区域体积"下选择"直径"，然后单击"完成"。要拆分构建曲面内的分组点，请单击构建点并进入过滤器。

接下来，单击"添加"按钮，然后选择"到曲面的最短距离"、"曲面曲面 1"作为过滤器类型。为下限设置最低阈值并为上限设置适当的值后，单击"将截面复制到新的 Spots"按钮。要自动计数单元格内的 EV，请单击"已建点 1"选项，转至"统计信息"，然后从"点总数"中导出值。

要获取像元数，请单击"构建曲面 1"，然后转至统计数据并导出"总体曲面总数"的值。最后，转到"统计信息"下的"详细信息"选项卡以导出卷。使用基于纳滤的微流体装置从PC3细胞培养基中分离的EV用氟-4偶联EV特异性抗体标记，并使用3D共聚焦显微镜可视化。

内化的EV被可视化为puncta，并且对这些图像的单独 EV.Post 处理允许将EV内化可视化和量化到细胞中。EV摄取测定结果表明，EV摄取水平取决于潜伏期的长度。内化EV的数量可以归一化为受体细胞体积，以确定指定细胞的实际EV摄取速率。

该程序允许系统地排除非内部化电动汽车，以精确测量内部化电动汽车的数量。此处显示了内化 EV 点的大小分布。因此，关键步骤是利用微流体装置进行EV标记，在可视化荧光EV时最小化背景荧光，然后进行成像后分析以确定内化与浅表的EV。

因此，可以在3D平面上实时执行细胞内EV跟踪，此外，还可以实现空间/时间分辨率的EV贩运分析以及EV与亚细胞器的共定位。因此，我们相信这种技术为电动汽车细胞通信领域的研究人员提供了一种更简单，更有效的方法来研究细胞内和细胞外基质中的EV。