이 프로토콜은 셀룰러 수준에서 전기를 분석하기 위한 강력한 방법론과 효율적인 EV 섭취 및 EV 추적 분석을 위한 실용적인 접근 방식을 제공합니다. 이 EV 라벨링 방법은 EV와 염료의 공동 침전을 제거하여 EV 신호를 향상시킵니다. EV 섭취량은 피상적 인 전기 EV와 내부화된 전기를 구별하기 위해 체적 분석에 의해 측정됩니다.
전기자동차는 활성 화물이므로, 이들의 섭취는 생화학분자의 전달을 허용한다. EV 기반 약물 전달 및 암 치료에 대한 연구를 위해이 기술은 평가 도구가 될 수 있습니다. EV 섭취량은 세포간 통신에서 중요한 역할을 하며 암 생물학, 신경과학 및 약물 전달과 같은 다양한 연구 분야에서 조사됩니다.
이 프로토콜은 잠재적으로 효율적인 EV uptake 분석작업을 용이하게 합니다. 세포외 소포 또는 전기 의 격리를 위해, 나노 여과 기반 미세 유체 장치의 샘플 챔버에 사전 처리 된 세포 배양 매체의 1 밀리리터를 주입한다. 장치를 작동하려면 벤치탑 회전 기계에서 장치를 3000 RPM에서 10분 동안 회전합니다.
회전 후, 파이펫팅 또는 흡입에 의해 폐기물 챔버에서 유체를 제거한 다음 세포 배양 매체의 추가 2 밀리리터를 처리하기 위해 이 절차를 두 번 반복합니다. 다음으로, 격리된 전기를 세척하고, 샘플 챔버에 PBS의 1밀리리터를 주입하고 벤치탑 회전 기계에서 장치를 회전시킵니다. 전기자동차의 면역형광 라벨링의 경우, EV 특이적 항체의 밀리리터당 1마이크로그램을 절연 된 전기 의 100 마이크로리터를 포함하는 장치의 용출 구멍에 주입한다.
그런 다음 플레이트 셰이커에서 어둠 속에서 1시간 동안 배양하여 시료를 가로지르는 항체의 균일한 분포를 보장합니다. 다음으로 용출 구멍에 접착제 테이프를 부착합니다. PBS의 1 밀리리터를 샘플 챔버에 주입하여 잔류 항체를 씻어낸 다음 샘플 챔버가 비어있을 때까지 장치를 회전시하십시오.
샘플 챔버에 PBS의 또 다른 밀리리터를 주입하고 이전에 설명한 대로 장치를 회전시켜 세척을 반복한다. 챔버에서 잔류 액을 제거 한 후, 광색 튜브 또는 마이크로 튜브로 멤브레인 챔버에서 형광 라벨 이비드 EV를 피펫. 사용까지 튜브를 빛으로부터 보호하십시오.
4번 10번 시드를 4번 1밀리리터 미디어로 35밀리리터 접시에 넣습니다. 세포가 최적의 세포 배양 조건에서 하룻밤 동안 부착되도록 합니다. 다음 날, 부착된 세포를 외성 고갈된 매체로 두 번 씻는다.
형광 라벨이 부착된 전기를 엑소좀 고갈된 매체를 사용하여 적절한 농도로 희석한 전기를 희석한 후, 희석된 전기자동차를 부착된 표적 세포에 추가하고 원하는 실험 시간 동안 배양한다. 외성 없는 매체로 세 번 세포를 세척하여 비내화 된 전기를 제거 한 후, CMTMR의 밀리리터 당 하나의 마이크로그램으로 부착 된 세포의 세포질에 라벨을 지정하고 최적의 세포 배양 조건에서 배양하십시오. 라이브 세포 이미징의 경우 준비된 세포를 무대 인큐베이터에 배치합니다.
제어 샘플을 기반으로 이미징 매개변수를 설정한 후, 3D 공초점 이미지를 획득하기 위해 Z 방향으로 표적 셀의 깊이와 스태킹 크기 범위를 결정한 다음, 세포별 염료 및 EV 특이적 염료의 여러 Z 적층 이미지로 이미지 수집을 동시에 설정합니다. 이미지 처리를 위해 자동 이미지 프로세싱 소프트웨어를 활용하십시오. 셀의 가상 표면을 빌드하려면 새 서피스 추가를 클릭합니다.
가상 셀 표면을 구성하려면 추가 단추를 클릭하고 품질을 필터 유형으로 선택합니다. 육안 검사에 의해 낮은 한계에 적합한 값을 임계값, 상한에 대한 최대 값을 설정하고, 다음 완료 버튼을 클릭하여 EV의 가상 점을 빌드하고, 버튼을 클릭하여 새 스팟 추가 버튼을 클릭합니다. 알고리즘 설정에서 다른 스팟 크기와 최단 거리 계산을 선택한 다음 을 클릭하고 채널 1 알렉사 플루오 488을 소스 채널로 선택합니다.
스팟 감지에서 예상 XY 직경에 적합한 값을 입력하고 다음을 클릭합니다. 가상 EV 점을 구성하려면 추가 단추를 클릭하고 품질을 필터 유형으로 선택합니다. 육안 검사를 통해 낮은 임계값을 설정하고 다음 을 클릭하면 스팟 영역 유형의 경우 절대 강도를 선택한 다음 을 클릭합니다.
EV 점 영역의 임계값을 임계값으로 설정하려면 육안으로 검사하여 지역 임계값에 적합한 값을 입력합니다. 지역 볼륨 아래에서 직경을 선택하고 마무리를 클릭합니다. 내장된 서피스 내부의 그룹화 된 스팟을 분할하려면 스팟 빌드를 클릭하고 필터로 이동합니다.
다음으로 추가 버튼을 클릭하고 표면에 가장 짧은 거리를 선택, 필터 유형으로 표면 1 표면 1. 낮은 제한에 대한 가장 낮은 임계값과 상한에 적합한 값을 설정한 후 중복 섹션을 새 스팟 단추로 클릭합니다. 셀 내부의 전기 EV자동 계산을 위해 빌드스팟 1 선택을 클릭하고 통계로 이동하여 총 반점 수에서 값을 내보냅니다.
셀 수를 얻으려면 기본 서피스 1을 클릭한 다음 통계로 이동하여 전체표면 총 수의 값을 내보냅니다. 마지막으로 통계 아래의 자세한 탭으로 이동하여 볼륨을 내보냅니다. 나노여과계 의 미세유체 장치를 이용하여 PC3 세포 배양 배지로부터 분리된 전기자동차는 플루오로-4-공주 된 EV 특이적 항체로 표지되고, 3D 공초점 현미경을 사용하여 시각화되었다.
내부화된 EV는 말장난으로 시각화되었으며 이러한 이미지의 개별 EV.Post 처리는 EV 내재화의 시각화 및 정량화를 세포로 시각화하고 정량화할 수 있게 합니다. EV 섭취량 분석 결과는 EV 섭취량수준이 인큐베이션 기간의 길이에 따라 달라지음을 나타냅니다. 지정된 셀에 대한 실제 EV 섭취량 속도를 결정하기 위해 내부화된 전기 TV의 수를 받는 셀 볼륨으로 정규화할 수 있습니다.
이 절차를 통해 비내부화된 EV를 체계적으로 배제하여 내부화된 EV 수를 정확하게 측정할 수 있습니다. 내부화된 EV 점의 크기 분포는 여기에 표시됩니다. 따라서 주요 단계는 EV 라벨링을 위한 미세 유체 장치의 사용, 형광 EV를 시각화할 때 배경 형광의 최소화, 그리고 이미징 후 분석을 통해 내부화 대 피상적 전기를 결정하는 것입니다.
따라서 세포 내 EV 추적은 3D 평면에서 실시간으로 수행 될 수 있으며, 또한, 공간 / 측두해상도에 대한 EV 인신 매매 분석 및 세포 외 세포 세포기관을 가진 EV의 공동 지역화를 달성 할 수 있습니다. 따라서 이 기술은 전기자동차의 세포통신 분야 내 의 연구자들을 위해 세포내 및 세포외 행렬 내에서 전기자동차를 보다 쉽고 효율적으로 조사할 수 있는 방법을 제공한다고 믿습니다.
