利用 MicroRNA 货物在新鲜冷冻人脑切片释放的小细胞外囊泡中的力量

如果及早发现，大多数健康状况可以得到更好的管理。可接触体液中的生物标志物是早期检测健康状况的最有前途的方法。我们报告了研究通过人脑小细胞外囊泡释放的 microRNA 生物标志物的方法的改进。

这种方法使我们能够识别不同遗传疾病亚型（如痴呆）之间小细胞外膀胱货物的变异，可以识别可以在外周液中检测到的货物生物标志物候选者，并加强疾病的早期诊断。因此，该方案平衡了效率、可及性和产品纯度，使其易于在不同实验室环境中重现。它不需要任何专用设备，预填充柱可提供一致性。

因此，任何生物标志物的发现都很容易转化为所需的临床结果。随着新的疾病缓解药物获得批准，诊断需要比目前更早地发现这些疾病，以最大限度地提高患者利益。诸如此类的方法将导致识别新的疾病相关 microRNA 生物标志物，从而可以使用特定的治疗和护理方案实现更好的健康管理。

我们将利用我们现有的能力开发识别组织和细胞类型特异性标志物的方法，这些标志物可以检测体液中发现的异质混合物中特定细胞类型释放的 microRNA 生物标志物。首先，在冷板上使用消毒过的手术刀将 250 毫克冷冻脑组织切成薄片。在冬眠溶液中加入每毫升 2 毫升 75 单位的 III 型胶原酶。

将每个样品置于 37 摄氏度的水浴中 20 分钟。在 5 分钟处，将样品倒置两次以混合。在 10 分钟标记处，使用 10 mL 塑料一次性条纹轻轻移液样品 3 次。

然后将每个样品置于冰上，并向每个样品中加入蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂。将每个脑组织样品在 4 摄氏度下以 300 G 离心 10 分钟。收集上清液。

然后在 4 摄氏度下以 2000G 离心 15 分钟。现在收集上清液并通过 0.22 微米过滤器过滤。然后将滤液在 10， 000G 下在 4 摄氏度下离心 48 分钟。

收集上清液后，以 2:1 的比例向每个样品中加入沉淀缓冲液。并将样品在 4 摄氏度下孵育过夜。然后将每个样品在 10， 000G 下在 4 摄氏度下离心 96 分钟。

并将沉淀重悬于 100 μL 无细胞外囊泡的 PBS 中。在室温下平衡预制的体积排阻色谱或 SEC 色谱柱 15 分钟。平衡后，从柱顶部去除保存缓冲液，并使用 250 μL 无细胞外囊泡的 PBS 洗涤柱两次。

然后将重悬的沉淀物加入色谱柱中，以 50G 离心 30 秒。弃去流出液后，加入 180 μL 不含 EV 的 PBS，并以 50G 离心柱 1 分钟，以使脑源性小细胞外囊泡洗脱。为了虱子细胞外小囊泡，用裂解液和提取缓冲液以相等的比例稀释分离的小细胞外囊泡样品。

在 4 摄氏度下搅拌稀释的样品 30 分钟。然后将样品在 14， 000G 下离心 15 分钟。收集蛋白质上清液并使用蛋白质测定试剂盒测量蛋白质浓度。

要进行纳米颗粒跟踪分析，请使用 1 至 1000 的稀释因子在 PBS 中稀释每个样品。将样品注入 NTA 仪器中。并将仪器设置为在 550 纳米的波长下读取样品。

根据 MISEV 指南，使用颗粒数量测量每颗粒的蛋白质量，以飞克为单位。接下来，在 PBS 中将细胞掩膜橙或 CMO 染料稀释 1 至 1000 的稀释因子。然后使用 1 至 10 稀释因子用小细胞外囊泡样品稀释 CMO 染料。

并将混合物在 4 摄氏度下避光孵育 30 分钟。现在，使用 PBS 以 1 至 1000 的稀释因子进一步稀释 CMO 染料小细胞外囊泡混合物。使用 NTA 仪器，在 550 纳米的波长下读取每个小细胞外囊泡样品的 CMO 染料。

对于荧光抗体示踪，使用 1 至 10 稀释倍数在 PBS 中稀释每种 tetraspan 和荧光抗体。然后用 1 到 10 的稀释因子用小细胞外囊泡样品稀释每种抗体染料。并将混合物在 4 摄氏度下避光孵育 2 小时。

接下来，使用稀释倍数为 1 至 1000 的 PBS 稀释第二种抗体混合物。使用 NTA 仪器在 550 纳米波长下读取小细胞外囊泡样品的荧光抗体信号。Western blot 分析证实，脑源性小细胞外囊泡中存在阳性标志物 CD9 、 CD63 、 CD81 、 Flotilla One 和 TSG101，而钙联结蛋白不存在，表明没有细胞污染。

纳米颗粒跟踪分析显示，分离的颗粒尺寸在 50 至 200 纳米之间，峰值浓度约为 100 纳米。CMO 染色数据显示，52.35% 的颗粒具有脂质双层，其中 34.66% 含有 CD9,15.49% 含有 CD63,12.01% 含有 CD81。