该方案的开发旨在为测量原代小鼠肝细胞中的总线粒体和过氧化物酶体脂肪酸β-氧化提供可靠的方法。使用完整细胞可以维持细胞器的完整性和调节机制。此外，检测新鲜分离的肝细胞可最大限度地减少基因表达相对于原产地肝脏的变化。
手术可能具有挑战性。你必须自信、勤奋和专注。一旦插管成功，尝试放松，但要注意并监测灌注的质量。
要开始该过程，请用70%乙醇自由喷洒麻醉小鼠的腹部和胸部。然后使用镊子拉起靠近腹部底部的皮肤和腹壁，并在中线的两侧横向切开，直到横膈膜以暴露器官。暴露下腔静脉或IVC，通过将肠道移动到右侧并轻轻地向上翻转肝脏叶。
在鼠标背面下方插入一个小圆柱形物体，例如针帽，以稍微倾斜IVC并促进插管。以最低速度启动带有缓冲液一的泵后，将针插入IVC。然后切开门静脉以减轻压力并允许血液和灌注缓冲液的引流。
在将流速增加到每分钟7毫升之前。用温缓冲液1灌注肝脏，并确保插入含有缓冲液1的管中的管线保持连续浸没状态，以避免引入气泡。在进行灌注时，加入130微升胶原酶溶液以缓冲液2，并通过用血清移液管移液混合。
当含有缓冲液一的试管中的体积减少到约5mL时，通过在试管侧面移液，缓慢加入5 mL缓冲液2至缓冲液1。重复添加两次，然后将剩余的缓冲液二加入管中。当约5至10mL缓冲液2留在管中时停止灌注。
然后切除肝脏并将其转移到含有20mL冰冷缓冲液的100mL培养皿中。在层流罩下，使用手术剪刀和镊子轻轻地将肝组织分开。接下来，向肝细胞悬浮液中加入约20mL冰冷的M199缓冲液，并使用注射器的柱塞通过100微米细胞过滤器过滤，以轻轻促进从较大的肝脏碎片中释放额外的肝细胞。
用M199缓冲液洗涤100mL培养皿和细胞过滤器以收集细胞悬浮液，直到收集管充满。然后在4摄氏度下以50×g离心悬浮液两分钟。吸出上清液，然后通过旋转将肝细胞沉淀重悬于30mL冷M199中。
重复洗涤一次。在制备用于多种反应的底物混合物之前，解冻棕榈酸和牛血清白蛋白或BSA溶液。在微量离心管中每次反应等分13.5微升BSA溶液。
将管加热至41摄氏度后，每次反应加入一微升200mM棕榈酸溶液。在41摄氏度孵育之前和期间，大力涡旋管20至30分钟，以促进可溶性棕榈酸 - BSA复合物的形成。在此期间，等分试样133微升1M高氯酸，其将用于在单独的1.5mL微量离心管中停止反应。
在开始反应之前，等分试样并将每次反应的485.5微升M199缓冲液孵育到37摄氏度的管中以稀释制备的放射性BSA-棕榈酸复合物。接下来，在单独的14 mL圆底管中分配750微升M199（含或不带抑制剂）作为样品。在肝细胞洗涤步骤中，在开始反应前10至15分钟，将管子转移到设置为37摄氏度的振荡水浴中，每分钟旋转180至200。
如果肝细胞的活力至少为75%，则通过将每次反应0.8微升碳-14棕榈酸转移到含有澄清的BSA-棕榈酸溶液的微量离心管中来完成底物混合物的制备。在将管子返回到41摄氏度的水浴之前进行涡旋。在最后一次肝细胞重悬后，立即使用一mL移液将750微升肝细胞悬浮液转移到振荡水浴中的每个14mL圆底管中，并在转移到培养箱之前以低速短暂涡旋管，将每次添加间隔30秒。
将单独的肝细胞等分试样转移到1.5mL微量离心管中，以3000×g旋转5分钟。在将沉淀以零下80摄氏度储存之前除去上清液，以测量样品中蛋白质的总量以使结果正常化。当肝细胞在37摄氏度下预孵育时，将放射性BSA-棕榈酸复合物加入温暖的培养基中以保持在37摄氏度，直到准备好开始反应。
要开始反应，从水浴中取出肝细胞，并向肝细胞中加入500微升底物混合物。以低速涡旋细胞五秒钟，然后返回水浴孵育15分钟。启动一组反应并立即停止以确定背景放射性。
转移并留出200至250微升剩余底物混合物的重复等分试样在6-mL闪烁小瓶中进行计数。为了停止反应，从水浴中取出肝细胞以以中等速度涡旋重悬，然后将400微升肝细胞悬浮液转移到含有高氯酸的微量离心管中。在对所有样品重复序列之前，立即盖上并涡旋试管，错开30秒。
在13， 000×g下旋转1.5mL微量离心管10分钟后，将300微升上清液转移到6mL闪烁小瓶中，并加入4mL闪烁液以计数样品中的放射性，并在闪烁计数器中将底物混合物等分试样计数。在研究中，肝脏灌注每个肝脏产生3000万至4000万个细胞，平均活力为80%，还观察到降低空腹组的葡萄糖浓度对肝细胞的产量或活力没有负面影响。从喂养和禁食的雄性小鼠中分离的肝细胞悬浮液在存在和不存在etomoxir（CPT1和线粒体脂肪酸氧化的有效抑制剂）的情况下测定脂肪酸β-氧化能力。
与背景放射性相关的每分钟计数或CPM随棕榈酸批次而变化。然而，CPM仍然显着低于与底物混合物一起孵育的样品。从禁食小鼠分离的肝细胞显示出线粒体和过氧化物酶体脂肪酸β-氧化速率的显着增加。
进一步研究了数据以确定从喂养和禁食小鼠分离的肝细胞中棕榈酸被氧化的速率。防止气泡进入线。在灌注期间保持针头稳定。
处理肝细胞时要温和。分配时，请将其悬架。从该程序中分离的肝细胞可以用作悬浮液来测定其他代谢途径，例如脂肪酸合成，或者它们可以接种用于细胞培养实验。
