פרוטוקול זה פותח כדי לספק שיטה חזקה למדידת סך כל חומצות השומן המיטוכונדריאליות והפרוקסיסומליות בטא-חמצון בפטוציטים ראשוניים של עכברים. השימוש בתאים שלמים שומר על שלמות האברונים ועל מנגנוני הוויסות הקיימים. בנוסף, בדיקת הפטוציטים שבודדו זה עתה ממזערת את השינויים בביטוי הגנים ביחס לכבד המוצא.
הניתוח יכול להיות מאתגר. אתה צריך להיות בטוח, חרוץ וממוקד. לאחר שהתותח מצליח, נסו להירגע, אך שימו לב ועקבו אחר איכות הזלוף.
כדי להתחיל את ההליך, לרסס בנדיבות את הבטן והחזה של העכבר המרדים עם 70% אתנול. לאחר מכן השתמש במלקחיים כדי למשוך את העור ואת דופן הבטן ליד בסיס הבטן ולחתוך לרוחב משני צדי קו האמצע ועד הסרעפת כדי לחשוף את האיברים. חשוף את הווריד הנבוב התחתון, או IVC, על ידי הזזת המעיים לצד ימין והפיכה עדינה של אונות הכבד כלפי מעלה.
הכנס אובייקט גלילי קטן, כגון מכסה מחט, מתחת לגב העכבר כדי להטות מעט את ה- IVC ולהקל על התותח. לאחר הפעלת המשאבה עם buffer אחד במהירות הנמוכה ביותר, להכניס את המחט לתוך IVC. לאחר מכן חותכים את וריד הפורטל כדי להקל על הלחץ ולאפשר ניקוז של מאגרי דם וזלוף.
לפני הגדלת קצב הזרימה לשבעה מ"ל לדקה. הוסיפו לכבד חיץ חם אחד וודאו שהקו המוחדר לצינור המכיל חיץ אחד נשאר שקוע באופן רציף כדי למנוע החדרת בועות אוויר. בזמן שמתרחשת זלוף, מוסיפים 130 מיקרוליטרים של תמיסת קולגן כדי לאגור שניים, ומערבבים על ידי צנרת עם פיפטה סרולוגית.
כאשר הנפח בצינור המכיל חיץ אחד יורד לכ-5 מ"ל, הוסיפו באיטיות חמישה מ"ל של חיץ שניים כדי לאגור אחד על ידי צנרת בצד הצינור. חזור על התוספת פעמיים לפני שתוסיף את שני המאגרים הנותרים לצינור. עצור את הזלוף כאשר כ 5 עד 10 מ"ל של חיץ שני נשארים בצינור.
לאחר מכן הוציאו את הכבד והעבירו אותו לתבשיל התרבית של 100 מ"ל המכיל 20 מ"ל של חיץ קר כקרח שניים. מתחת למכסה המנוע של הזרימה הלמינרית, מפרקים בעדינות את רקמת הכבד באמצעות מספריים כירורגיים ופינצטה. לאחר מכן מוסיפים כ-20 מ"ל של חיץ M199 קר כקרח לתרחיף הפטוציטים ומסננים אותו דרך מסננת תאים של 100 מיקרון באמצעות בוכנה של מזרק כדי לקדם בעדינות את שחרורם של הפטוציטים נוספים מחתיכות הכבד הגדולות יותר.
יש לשטוף את תבשיל התרבית של 100 מ"ל ואת מסננת התאים עם מאגר M199 כדי לאסוף את תרחיף התא עד שצינור האיסוף מתמלא. לאחר מכן צנטריפוגה את ההשעיה ב 50 x g במשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס. לשאוף את supernatant לפני החייאה של כדור hepatocyte ב 30 מ"ל של M199 קר על ידי מערבולת.
חזור על הכביסה פעם אחת. להפשיר את החומצה הדקלמית ואת אלבומין סרום בקר, או BSA, תמיסות לפני הכנת תערובת המצע לתגובות מרובות. אליקוט 13.5 מיקרוליטרים של תמיסת BSA לכל תגובה בצינור מיקרוצנטריפוגה.
לאחר חימום הצינור ל-41 מעלות צלזיוס, הוסיפו מיקרוליטר אחד של תמיסת החומצה הדקלמית של 200 mM לכל תגובה. מערבולת הצינור במרץ לפני ובמהלך הדגירה ב 41 מעלות צלזיוס במשך 20 עד 30 דקות כדי להקל על היווצרות של קומפלקס חומצה פלמיטית מסיסה-BSA. במהלך תקופה זו, aliquot 133 microliters של 1 M של חומצה פרכלורית אשר ישמשו כדי לעצור את התגובות בצינורות מיקרוצנטריפוגה נפרדים 1.5 מ"ל.
לפני תחילת התגובות, aliquot ודגירה של 485.5 מיקרוליטרים של חיץ M199 לכל תגובה לתוך צינור ב 37 מעלות צלזיוס כדי לדלל את קומפלקס החומצה הרדיואקטיבית BSA-palmitic מוכן. לאחר מכן מחלקים 750 מיקרוליטרים של M199 עם או בלי מעכבים בצינורות התחתונים העגולים הנפרדים של 14 מ"ל כדגימות. במהלך שלבי שטיפת הפטוציטים, 10 עד 15 דקות לפני תחילת התגובות, מעבירים את הצינורות לאמבטיית מים רועדת שנקבעה ל-37 מעלות צלזיוס ב-180 עד 200 סיבובים לדקה.
אם הכדאיות של hepatocytes הוא לפחות 75% להשלים את ההכנה של תערובת המצע על ידי העברת 0.8 microliters של פחמן-14 חומצה פלמיטית לכל תגובה לצינור microcentrifuge המכיל את תמיסת חומצה BSA-palmitic הבהיר. מערבולת לפני החזרת הצינור לאמבטיית המים בטמפרטורה של 41 מעלות צלזיוס. מיד לאחר ההחייאה הסופית של הפטוציטים, העבירו 750 מיקרוליטרים של תרחיף הפטוציטים לכל אחד מהצינורות התחתונים העגולים של 14 מ"ל באמבט המים הרועד באמצעות פיפטה אחת של מ"ל ומערבולת הצינורות לזמן קצר במהירות הנמוכה לפני המעבר לחממה, מה שמזעזע כל תוספת ב-30 שניות.
מעבירים אליקוט נפרד של הפטוציטים לצינור מיקרו-צנטריפוג של 1.5 מ"ל כדי להסתובב ב-3000 x גרם במשך חמש דקות. הסר את הסופרנטנט לפני אחסון הכדור במינוס 80 מעלות צלזיוס כדי למדוד את כמות החלבון הכוללת בדגימה כדי לנרמל את התוצאות. בזמן שההפטוציטים נמצאים תחת דגירה מוקדמת ב-37 מעלות צלזיוס, הוסיפו את קומפלקס החומצה הרדיואקטיבית BSA-palmitic למדיום החם כדי לשמור על 37 מעלות צלזיוס עד שיהיו מוכנים להתחיל את התגובות.
כדי להתחיל את התגובות, להסיר את hepatocytes מן האמבטיה מים ולהוסיף 500 microliters של תערובת המצע hepatocytes. מערבולת את התאים במהירות נמוכה במשך חמש שניות לפני שהם חוזרים לאמבטיית המים כדי לדגור במשך 15 דקות. התחל קבוצה של תגובות ומיד עצור כדי לקבוע את הרדיואקטיביות ברקע.
מעבירים ומניחים בצד את האליקוטים הכפולים של 200 עד 250 מיקרוליטרים של שאריות המצע בתערובת המצע הנותרת בבקבוקוני 6 מ"ל כדי לבצע את הספירה. כדי לעצור את התגובות, הסר את הפטוציטים מאמבט המים כדי לבצע החייאה על ידי מערבולת במהירות מתונה ולאחר מכן העבר 400 מיקרוליטרים של תרחיף הפטוציטים לצינורות microcentrifuge המכילים חומצה פרכלורית. מיד מכסה ומסובב את הצינורות לפני שחוזרים על הרצף של כל הדגימות, מזעזע ב -30 שניות.
לאחר סיבוב במורד צינורות המיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל ב-13, 000 x g למשך 10 דקות, מעבירים 300 מיקרוליטרים של ה-supernatant לבקבוקון ציצית של 6 מ"ל ומוסיפים 4 מ"ל מ"ל של נוזל הציצית כדי לספור את הרדיואקטיביות בדגימות ואת תערובת המצעים אליקוטים במונה סקינטילציה. במחקר, זלוף הכבד הניב 30 עד 40 מיליון תאים לכל כבד, עם כדאיות ממוצעת של 80%, כמו כן נצפתה כי הורדת ריכוז הגלוקוז בקבוצת הצום לא השפיעה לרעה על התשואה או הכדאיות של הפטוציטים. תרחיף הפטוציטים, שבודד מעכברים זכרים שניזונו וצום, נבדקו לצורך יכולת חמצון בטא של חומצת שומן בנוכחות ובהיעדר אטומוקסיר, מעכב רב עוצמה של CPT1 וחמצון חומצות שומן מיטוכונדריאליות.
הספירות לדקה, או CPM, הקשורות לרדיואקטיביות הרקע משתנות עם קבוצת החומצה הדקלמית. עם זאת, CPM עדיין היה נמוך משמעותית מהדגימות שהודגמו בתערובת המצע. ההפטוציטים שבודדו מהעכברים הצומים מראים עלייה חזקה בשיעורי החמצון של חומצת שומן מיטוכונדריאלית ופרוקסיזומית.
הנתונים נחקרו עוד יותר כדי לקבוע את הקצב שבו חומצה פלמיטית מתחמצנת בהפטוציטים המבודדים מהעכברים המוזנים והצומים. מנעו מבועות להיכנס לקו. שמור על המחט יציבה במהלך הזלוף.
היו עדינים בעת הטיפול בהפטוציטים. שמור אותם במתלים בעת חלוקתם. הפטוציטים המבודדים מהליך זה יכולים לשמש כתרחיף כדי לבחון מסלולים מטבוליים אחרים, כגון סינתזה של חומצות שומן, או שניתן לצפות אותם לניסויים בתרביות תאים.
