使用¹⁴CO₂捕获在体外评估能量底物氧化

使用不同的能量底物既是细胞类型特异性的，也是疾病的指示性。测量特定底物的消耗量可以揭示正常的生物学和病理学。该技术不需要专门的设备，并且易于扩展。

它也比以前发布的方法更易于使用。了解底物氧化速率的变化将允许开发代谢紊乱的饮食和药物干预。虽然在骨组织中得到了证明，但该技术很容易定制，以研究所有细胞类型的代谢灵活性，从而了解代谢转移的原因和后果。

在牺牲幼崽产后三至五天后，将其转移到含有青霉素链霉素双抗生素溶液的冰冷D PBS中。通过去除皮肤和软组织来暴露颅骨。通过在D PBS中从后到前切割周围组织来收集中间区域。

用镊子轻轻划伤颅骨的内表面和外表面，以帮助在随后的消化时释放细胞。在D PBS中制备每毫升2和4毫克的二型胶原酶溶液，并用新鲜的0.22微米过滤器过滤每个溶液。首先，用每毫升两毫克胶原酶溶液消化清洁的颅骨15分钟，然后丢弃消化溶液。

接下来，将干净的样品在每毫升四毫克胶原酶溶液中消化三次，每次15分钟。然后，拉动消解液并保存。通过70微米细胞过滤器过滤消化溶液，并将滤液在300 RCF离心五分钟。

将细胞沉淀重新悬浮在含有10%FBS和青霉素链霉素双抗生素溶液的完全MEMα培养基中。将细胞计数并接种在10厘米的平板中。将细胞在37摄氏度的培养箱中用5%二氧化碳培养三天。

然后，在37摄氏度下用0.25胰蛋白酶EDTA解离细胞。消化后，用含有10%FBS和青霉素链霉素双抗生素溶液的完整MEM α培养基在24孔细胞培养板中计数和接种细胞。每个底物的每个细胞类型至少接种四个孔，每个细胞类型至少接种三个额外的孔，用于预测定计数。

将细胞在37摄氏度下培养过夜。从八周龄的小鼠身上取出肌肉和结缔组织并收集股骨和胫骨后，用锋利的剪刀切割并丢弃骨骼的两端。将骨髓从一个股骨和一个胫骨冲洗到新鲜的10厘米培养皿中，注射器装有23号针头，其中含有15毫升完整的MEMα培养基，10%FBS青霉素链霉素双抗生素溶液和10%CGM 14 12条件培养基。

在培养皿中用5%二氧化碳培养37摄氏度的培养箱中培养细胞。三天后，丢弃培养基并用D PBS冲洗细胞。在37摄氏度下用0.25%胰蛋白酶EDTA解离附着的细胞五分钟。

离心后，将细胞沉淀重新悬浮在BMM培养基中。按照前面描述的程序在24孔细胞培养板中计数并接种细胞。在开始测定之前，在37摄氏度下在BMM培养基中培养过夜。

用D PBS洗涤额外孔中的细胞两次。用0.25%胰蛋白酶EDTA解离细胞。在D PBS中重新悬浮20微升消化的细胞。

用20微升吖啶橙和碘化丙啶染料溶液，用自动细胞计数器确定活细胞的数量并记录数量。用D PBS洗涤测定孔中的细胞两次。向RAM指定的组织培养罩中的每个测定孔中加入500微升热培养基。

用parafilm密封板后，将细胞在37摄氏度的RAM指定培养箱中孵育4小时。在孵育过程中，将滤纸切成圆形片，略大于1.5毫升微量离心管盖内的面积，并将纸紧紧地插入盖中。向每个管中加入200微升1摩尔高氯酸，向盖子内的滤纸中加入20微升氢氧化钠。

孵育细胞后，将400微升培养基从每个孔转移到制备的试管中并立即关闭盖子。将试管在室温下放入管架中一小时。在孵育过程中，Parallelae为每个管子设置一个闪烁小瓶，并用四毫升闪烁流体填充它。

将每张滤纸转移到闪烁小瓶中，并在室温下孵育30分钟。在组织培养罩、水浴、冰箱、培养箱、水槽、地面和任何其他工作区域进行擦拭测试，以发现潜在的RAM污染。将纸擦拭布放入含有闪烁液的闪烁小瓶中。

使用闪烁计数器测量闪烁小瓶中的碳14无线电活性并记录读数结果。如有必要，根据辐射安全指南对工作环境进行净化。该图比较了原代颅骨成骨细胞前细胞与BMM的底物氧化。

在原代细胞在完整的MEM α培养基中传代和培养过夜后，它们通常达到80%至90%汇合并表现出其特征形态。颅变成骨前细胞明显大于BMM。底物氧化的结果表明，在颅变成骨前体中，每种底物的氧化速率显着高于BMM，可能表明在成骨细胞前通过氧化磷酸化产生更高的能量。

插入的第三张纸应略大于1.7毫升的埃宾顶管盖。该方法可以与氧气消耗结合使用，并确定细胞中氧化磷酸化和乳酸产生的总速率。该协议可用于在不同的分化阶段或疾病设置期间确定底物的使用。

有了这些知识，我们可以开发代谢紊乱的干预措施。