Этот протокол был разработан для обеспечения надежного метода измерения общего бета-окисления митохондриальных и пероксисомальных жирных кислот в первичных гепатоцитах мыши. Использование интактных клеток поддерживает целостность органелл и регуляторные механизмы. Кроме того, анализ свежеизолированных гепатоцитов минимизирует изменения в экспрессии генов по отношению к печени происхождения.
Операция может быть сложной. Вы должны быть уверенными, прилежными и сосредоточенными. Как только каннюляция будет успешной, попробуйте расслабиться, но обратите внимание и следите за качеством перфузии.
Для начала процедуры обильно опрыскайте брюшную полость и грудную клетку обезболенной мыши 70% этанолом. Затем используйте щипцы, чтобы подтянуть кожу и брюшную стенку возле основания живота и разрезать латерально по обе стороны от средней линии и до диафрагмы, чтобы обнажить органы. Обнажите нижнюю полую вену, или IVC, переместив кишечник в правую сторону и осторожно перевернув доли печени вверх.
Вставьте небольшой цилиндрический объект, такой как колпачок иглы, под заднюю часть мыши, чтобы слегка наклонить IVC и облегчить канюляцию. После запуска насоса с буферным насосом на самой низкой скорости вставьте иглу в IVC. Затем перережьте воротную вену, чтобы снять давление и обеспечить дренаж крови и перфузионных буферов.
Перед увеличением расхода до семи мл в минуту. Перфузируйте печень теплым буферным и убедитесь, что линия, вставленная в трубку, содержащую буферную, остается непрерывно погруженной, чтобы избежать введения пузырьков воздуха. Пока происходит перфузия, добавляют 130 микролитров раствора коллагеназы в буфер два и смешивают путем пипетки с серологической пипеткой.
Поскольку объем в трубке, содержащей буфер один, уменьшается примерно до пяти мл, медленно добавляйте пять мл буферных двух в буферный один путем пипетирования на боковой стороне трубки. Повторите добавление дважды, прежде чем добавлять оставшиеся два буфера в трубку. Прекратите перфузию, когда в трубке останется от 5 до 10 мл буферных двух.
Затем иссечь печень и переложить ее в 100-мл культуральную чашку, содержащую 20 мл ледяного буфера два. Под ламинарным капюшоном аккуратно разбейте ткань печени с помощью хирургических ножниц и пинцета. Затем добавьте около 20 мл ледяного буфера M199 в суспензию гепатоцитов и отфильтруйте его через 100-микронный клеточный сетчатый фильтр, используя поршень шприца, чтобы мягко способствовать высвобождению дополнительных гепатоцитов из более крупных кусочков печени.
Промыть чашку для культивирования 100 мл и клеточный фильтр с буфером M199, чтобы собрать клеточную суспензию до тех пор, пока трубка для сбора не заполнится. Затем центрифугируют суспензию при 50 х г в течение двух минут при четырех градусах Цельсия. Аспирируйте супернатант перед повторным использованием гранулы гепатоцитов в 30 мл холодного M199 путем закручивания.
Повторите стирку один раз. Разморозьте растворы пальмитиновой кислоты и бычьего сывороточного альбумина, или BSA, перед приготовлением субстратной смеси для нескольких реакций. Aliquot 13,5 микролитров раствора BSA на реакцию в микроцентрифужной трубке.
После нагревания трубки до 41 градуса Цельсия добавляют один микролитр раствора пальмитиновой кислоты 200 мМ за реакцию. Энергично вращайте трубку до и во время инкубации при температуре 41 градус Цельсия в течение 20-30 минут, чтобы облегчить образование растворимого комплекса пальмитиновой кислоты-BSA. За это время аликвотирует 133 микролитра 1 М хлорной кислоты, которые будут использоваться для остановки реакций в отдельных 1,5-мл микроцентрифужных пробирках.
Перед началом реакций аликвоту и инкубируют 485,5 микролитров буфера M199 за реакцию в трубку при температуре 37 градусов Цельсия для разбавления полученного радиоактивного комплекса BSA-пальмитиновой кислоты. Далее дозируют 750 микролитров M199 с ингибиторами или без них в отдельные 14-мл трубки с круглым дном в качестве образцов. Во время этапов промывания гепатоцитов, за 10-15 минут до начала реакций, перенесите трубки на встряхивающую водяную баню, установленную на 37 градусов Цельсия со скоростью от 180 до 200 оборотов в минуту.
Если жизнеспособность гепатоцитов составляет не менее 75%, завершают приготовление субстратной смеси путем переноса 0,8 микролитра углерод-14 пальмитиновой кислоты за реакцию в микроцентрифужную трубку, содержащую осветленный раствор BSA-пальмитиновой кислоты. Вихрь перед возвращением трубки на водяную баню при 41 градусе Цельсия. Сразу после окончательной ресуспензии гепатоцитов переведите 750 микролитров суспензии гепатоцитов в каждую из 14-мл круглых нижних трубок на встряхивающей водяной бане с помощью пипетки в один мл и кратковременно вихрьте трубки на низкой скорости перед переносом в инкубатор, ошеломляя каждое добавление на 30 секунд.
Переведите отдельную аликвоту гепатоцитов в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл для вращения при 3000 х г в течение пяти минут. Удалите супернатант перед хранением гранулы при минус 80 градусах Цельсия, чтобы измерить общее количество белка в образце для нормализации результатов. В то время как гепатоциты находятся под предварительной инкубацией при 37 градусах Цельсия, добавьте радиоактивный комплекс BSA-пальмитиновой кислоты в теплую среду, чтобы поддерживать при 37 градусах Цельсия до тех пор, пока они не будут готовы к началу реакций.
Чтобы начать реакцию, удалите гепатоциты с водяной бани и добавьте к гепатоцитам 500 микролитров субстратной смеси. Вращайте клетки с низкой скоростью в течение пяти секунд, прежде чем вернуться на водяную баню, чтобы инкубировать в течение 15 минут. Запустите комплекс реакций и немедленно остановитесь, чтобы определить фоновую радиоактивность.
Переложите и отложите дубликаты аликвот от 200 до 250 микролитров оставшейся субстратной смеси в 6-мл сцинтилляционных флаконах для выполнения подсчета. Чтобы остановить реакции, удалите гепатоциты с водяной бани для повторного суспендирования путем вихря с умеренной скоростью, а затем перенесите 400 микролитров суспензии гепатоцитов в микроцентрифужные трубки, содержащие хлорную кислоту. Немедленно закройте и вихрьте трубки, прежде чем повторить последовательность для всех образцов, ошеломляя на 30 секунд.
После раскрутки 1,5 мл микроцентрифужных трубок при 13 000 х г в течение 10 минут переложите 300 микролитров супернатанта в 6-мл сцинтилляционный флакон и добавьте 4 мл сцинтилляционной жидкости для подсчета радиоактивности в образцах и подложки смешивают аликвоты в сцинтилляционном счетчике. В исследовании перфузия печени дала от 30 до 40 миллионов клеток на печень, со средней жизнеспособностью 80% Также было замечено, что снижение концентрации глюкозы в группе натощак не оказало негативного влияния на выход или жизнеспособность гепатоцитов. Суспензию гепатоцитов, выделенную у скармливаемых и голодающих самцов мышей, анализировали на способность к бета-окислению жирных кислот в присутствии и отсутствии этомоксира, мощного ингибитора CPT1 и окисления митохондриальных жирных кислот.
Количество в минуту, или CPM, связанное с фоновой радиоактивностью, варьируется в зависимости от партии пальмитиновой кислоты. Однако CPM по-прежнему был значительно ниже, чем образцы, инкубированные со смесью субстрата. Гепатоциты, выделенные у мышей натощак, показывают устойчивое увеличение скорости бета-окисления как митохондриальных, так и пероксисомальных жирных кислот.
Данные были дополнительно изучены для определения скорости, с которой пальмитиновая кислота окисляется в гепатоцитах, выделенных у сытых и голодающих мышей. Предотвращение попадания пузырьков в линию. Держите иглу устойчивой во время перфузии.
Будьте осторожны при обращении с гепатоцитами. Держите их в подвешенном состоянии при их дозировании. Гепатоциты, выделенные в результате этой процедуры, могут быть использованы в качестве суспензии для анализа других метаболических путей, таких как синтез жирных кислот, или они могут быть покрыты для экспериментов с клеточными культурами.
