我们的研究结果表明，优化内皮细胞心肌细胞共培养的空间环境对于提供有利的体外模型，用于测试内皮细胞在心肌细胞保护模拟缺血再繁殖损伤中的作用是必要的。细胞共培养模型已被广泛用于研究细胞 - 细胞相互作用对细胞功能和分化的作用。然而，在混合共培养中，细胞类型之间的单独处理和单细胞类型的下游分析并不容易实现。
目前的研究旨在创建两个独立的细胞层，它们之间有有意义的距离，其中可以诱导缺氧再繁殖损伤，并研究结果和对单细胞类型的影响。通过解冻两个细胞系开始准备。用新鲜培养基洗涤后，将细胞接种在T25烧瓶中。
第二天，用培养基刷新细胞，并在汇合时使用。将细胞培养箱保持在37摄氏度，含21%氧气，5%二氧化碳和74%氮气。保持加湿。
在光学显微镜下估计心肌细胞系汇合度。从含有融合细胞培养物的烧瓶中取出培养基，并用每个烧瓶三至五毫升胰蛋白酶-EDTA胰蛋白酶消化。轻轻搅拌烧瓶，在37摄氏度下孵育两到五分钟。
之后，在光学显微镜下评估酶的进展。分离后，通过将trysin或细胞溶液加入每个T25烧瓶中含有10毫升培养基的50毫升管中来灭活胰蛋白酶溶液。将细胞悬浮液以120×g离心两分钟，得到软细胞沉淀。
离心后，除去上清液并将沉淀重悬于五毫升培养基中。接下来，进行细胞计数并确认细胞活力。混合并等分试样10微升重悬细胞和10微升台盼蓝染料，然后使用细胞计数器计数活细胞。
用新鲜的常规培养基稀释细胞，以达到所需的接种密度。将24孔板用细胞外基质预涂覆，并将接种密度为每孔300， 000的板心肌细胞涂在板的底部。将细胞保持在37摄氏度，含5%二氧化碳过夜。
24小时后，将内皮细胞以每插入物100， 000的最佳电镀密度将内皮细胞板放入插入物中。内皮细胞接种24小时后，将内皮细胞插入心肌细胞孔内并开始共培养。在进行实验之前，让细胞共培养12至24小时。
通过将大约25毫升的培养基倒入50毫升锥形管中来制备缺氧培养基。用硅胶膜空气密封顶部，并使用无菌移液器打孔。之后，创建另一个孔，并将大约2/3的移液器浸没在介质中。
以每分钟30升的流速用缺氧气体冲洗培养基5分钟，然后丢弃含有附着细胞的24孔板或培养插入物的培养基。用每孔100微升10%PBS非常温和地洗涤它们，向每个孔的板或插入物中加入500微升新鲜制备的缺氧培养基。用常氧对照组中含有葡萄糖和血清的新鲜正常培养基替换原始培养基。
将装满无菌水的培养皿放入缺氧室中以加湿室。然后将含有缺氧基团的板放入腔室中。用缺氧气体以每分钟30升的流量冲洗缺氧室五分钟。
之后，将腔室放在37摄氏度的培养箱内24小时。缺氧后，丢弃板或插入物的旧培养基，并在板的每种壁上加入500微升含有葡萄糖和血清的正常培养基，然后将板在正常培养条件下的培养箱内储存两小时以模拟再灌注。将细胞培养基从24孔板转移到96孔板中，然后从24孔板的每个孔中取出200微升培养基，并均匀分布到96孔板的四个孔中。
使用96孔板中的细胞毒性测定试剂盒测量LDH的吸光度，并按照制造商的说明确定细胞损伤的程度。在这项研究中，评估了三种类型的插入物。所有三个插入物的孔径均为0.4微米。
它们之间的唯一区别是插入物到碱基高度，允许两个共培养细胞层之间的距离为0.5，1.0和2.0毫米。使用该协议，在正常氧气条件下培养细胞，然后分成两组，常氧对照组和缺氧组。24小时后，用培养基刷新两组，并在正常氧气条件下再培养两小时，然后进行终点测定。
本文比较了三种类型的培养插入物在正常氧、仅缺氧和缺氧再氧条件下评估乳酸脱氢酶释放的单独心肌细胞、单独内皮细胞和心肌细胞与内皮细胞共培养的分布。由于细胞层之间的距离为0.5毫米，与单独培养心肌细胞时的正常氧相比，缺氧导致LDH释放显着增加。然而，与仅缺氧组相比，缺氧复氧组的LDH仅略有增加。
当内皮细胞和心肌细胞一起共培养时，仅缺氧条件下LDH释放的增加没有减弱。这表明，在仅缺氧条件下，与单独心肌细胞组相比，内皮细胞没有任何保护作用。然而，内皮细胞在HR期间对心肌细胞施加了温和但显着的保护。当细胞层之间的距离为1毫米时，仅在缺氧条件下，心肌细胞的LDH释放也显着增加。
然而，与0.5毫米插入物不同，心肌细胞的LDH增加仅由HR优于仅缺氧条件增强。这种增加在两毫米插入时更加明显。将接种在两毫米插入物中的内皮细胞的浓度分别滴定为每插入物25，000，50，000和100，000个细胞。
研究发现，共培养物中内皮细胞强度的增加导致HR引起的LDH释放的剂量依赖性衰减。然而，在常氧条件下没有看到这种效应。这种共培养方法不仅限于内皮细胞和心肌细胞。这些方法应有助于研究跨多个感兴趣器官的不同细胞系之间的特定细胞 - 细胞相互作用。
