הממצאים שלנו מראים כי אופטימיזציה של הסביבה המרחבית של קרדיומיוציטים של תאי אנדותל יש צורך לספק מודל הפריה חוץ גופית חיובי לבדיקת התפקיד של תאי אנדותל בהגנה על קרדיומיוציטים מפני פגיעה מדומה של איסכמיה. מודלים של תרבית משותפת של תאים שימשו בהרחבה כדי לחקור את התפקיד של אינטראקציות תא-תא על תפקוד התא ובידול. עם זאת, טיפולים נפרדים בין סוגי תאים וניתוח במורד הזרם של סוג תא יחיד אינם אפשריים בקלות בתרבות המשותפת המעורבת.
המחקר הנוכחי נועד ליצור שתי שכבות תאים נפרדות עם מרחק משמעותי ביניהן שבו ניתן לגרום לפגיעה בהיפוקסיה ולחקור את התוצאה וההשפעות על סוג תא יחיד. התחל את ההכנה על ידי הפשרת שני קווי התא. צלחת את התאים בבקבוקונים T25 לאחר שטיפת אותם עם מדיה טרייה.
למחרת, רענן את התאים במדיה והשתמש בהם כאשר הם נפגשים. לשמור על אינקובטור תרבית התא ב 37 מעלות צלזיוס עם 21% חמצן, 5% פחמן דו חמצני, ו 74% חנקן. שמור את זה לח.
הערך את צפיפות קו התאים של קרדיומיוציטים תחת מיקרוסקופ אור. הסר את המדיה מהבקבוקונים המכילים תרביות תאים משולבות ו trypsinize עם שלושה עד חמישה מיליליטרים של טריפסין-EDTA לכל בקבוקון. להסעיר את הבקבוק בעדינות ודגור ב 37 מעלות צלזיוס במשך שתיים עד חמש דקות.
לאחר מכן, להעריך את ההתקדמות אנזימטית תחת מיקרוסקופ אור. לאחר ניתוק, להשבית את פתרון טריפסין על ידי הוספת פתרון trysin או תא לצינור 50 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של מדיה לכל בקבוק T25. צנטריפוגה השעיית התא ב 120 x g במשך שתי דקות כדי לקבל גלולה תא רך.
לאחר צנטריפוגה, להסיר את supernatant ו resuspend את הכדור בחמישה מיליליטר של מדיה. לאחר מכן, בצע ספירת תאים ואשר את הכדאיות של התא. מערבבים ו aliquot של 10 מיקרוליטרים של תאים resuspended ו 10 microliters של צבע כחול טריפאן, ולאחר מכן לספור את התאים החיים באמצעות מונה תאים.
לדלל את התאים עם מדיה רגילה טרייה כדי להשיג את צפיפות הזריעה הרצויה. קח צלחת 24-well מראש לצפות אותו עם מטריצה חוץ תאית ו cardiomyocytes צלחת בצפיפות זריעה של 300, 000 לכל באר על החלק התחתון של הצלחת. לשמור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% דו תחמוצת הפחמן בן לילה.
לאחר 24 שעות, תאי אנדותל צלחת לתוך תוספות בצפיפות ציפוי אופטימלית של 100, 000 לכל הוספה. לאחר 24 שעות של ציפוי תאי אנדותל, הניחו את תאי האנדותל בתוך בארות הקרדיומיוציטים ויזמו תרבות משותפת. אפשר לתאים לתרבות משותפת במשך 12 עד 24 שעות לפני ביצוע הניסויים.
הכן את התקשורת ההיפוקסית על ידי שפיכת כ -25 מיליליטר של מדיה בצינור חרוטי 50 מיליליטר. האוויר אוטם את החלק העליון עם קרום סיליקון ומשתמש בפיפטה מעוקרת כדי לנקב חור. לאחר מכן, ליצור חור נוסף ולהשאיר כ 2/3 של פיפטות שקועות בתקשורת.
יש לשטוף את המדיה בגז היפוקסי למשך חמש דקות בקצב זרימה של 30 ליטר לדקה, ולאחר מכן להשליך את המדיה של הלוחות או תוספות התרבות של 24 הבארות המכילות תאים מצורפים. לשטוף אותם בעדינות רבה עם 100 microliters של 10% PBS לכל היטב להוסיף 500 מיקרוליטרים של מדיה היפוקסית מוכן טרי לכל באר של הצלחות או תוספות. החלף את המדיה המקורית במדיה רגילה ורעננה המכילה גלוקוז וסרום בקבוצת הביקורת הנורמוקסלית.
מניחים צלחת פטרי מלאה במים סטריליים לתוך תא היפוקסיה כדי לח את התא. לאחר מכן מניחים את הלוחות המכילים את הקבוצות ההיפוקסיות לתוך התא. לשטוף את תא היפוקסיה עם גז היפוקסי במשך חמש דקות בזרימה של 30 ליטר לדקה.
לאחר מכן, מניחים את התא בתוך אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. לאחר היפוקסיה, השליכו את המדיה הישנה של הצלחות או התוספות והוסיפו 500 מיקרוליטרים של מדיה רגילה המכילה גלוקוז וסרום לכל קיר של הצלחות, ולאחר מכן אחסנו את הצלחות בתוך אינקובטור בתנאי תרבות רגילים במשך שעתיים כדי לחקות רפרטפוזיה. העבירו את מדיית תרבית התאים מהצלחת בת 24 הבאר לצלחת של 96 בארות, ואז קחו 200 מיקרוליטרים של מדיה מכל באר של הצלחת בת 24 הבאר ומחולקים באופן שווה לארבע בארות של צלחת 96 הבאר.
מדוד את הספיגה עבור LDH באמצעות ערכת בדיקת ציטוטוקסיות בצלחת של 96 בארות ובצע את הוראות היצרן כדי לקבוע את מידת הפגיעה התאית. במחקר זה, שלושה סוגים של תוספות הוערכו. כל שלושת התוספות היו באותו גודל נקבוביות של 0.4 מיקרומטר.
ההבדל היחיד ביניהם היה התוספת לגובה הבסיס, המאפשרת את המרחקים בין שתי שכבות התאים בתרבית משותפת להיות 0.5, 1.0 ו 2.0 מילימטרים. באמצעות פרוטוקול זה, תאים היו בתרבית בתנאי חמצן רגילים ולאחר מכן לפצל לשתי קבוצות קבוצת בקרה נורמוקסית וקבוצת היפוקסיה. לאחר 24 שעות, שתי הקבוצות התרעננו עם מדיה ותרבית בתנאי חמצן רגילים במשך שעתיים נוספות לפני ביצוע בדיקות נקודת הקצה.
השוואה של שלושת סוגי תרבית מוסיף בהערכת שחרור dehydrogenase לקטט עבור cardiomyocyte לבד, תאי אנדותל לבד, ותרבות משותפת של cardiomyocyte עם תאי אנדותל מוצג כאן תחת נורמוקסיק, היפוקסיה בלבד, היפוקסיה בלבד, היפוקסיה, היפוקסיה reoxygenation תנאים. עם מרחק של 0.5 מילימטר בין שכבות התא, היפוקסיה הובילה לשחרור LDH מוגבר באופן משמעותי בהשוואה לנורמוקסיה כאשר קרדיומיוציטים היו מתורבתים לבד. עם זאת, LDH היה רק גדל מעט בקבוצת reoxygenation היפוקסיה בהשוואה לקבוצת היפוקסיה בלבד.
כאשר תאי אנדותל וקרדיומיוציטים היו בתרבית משותפת יחד, העלייה של שחרור LDH תחת התנאים היפוקסיה בלבד לא נחלש. זה מצביע על כך שלתאי האנדותל לא הייתה השפעה מגנה בהשוואה לקבוצת הקרדיומיוציטים בלבד תחת תנאי היפוקסיה בלבד. עם זאת, תאי אנדותל הפעילו הגנה קלה אך משמעותית על קרדיומיוציטים במהלך משאבי אנוש. כאשר המרחק בין שכבות התא היה מילימטר אחד, שחרור LDH היה גם גדל באופן משמעותי קרדיומיוציטים רק תחת מצב היפוקסיה בלבד.
עם זאת, שלא כמו בהכנסת 0.5 מילימטר, העלייה LDH קרדיומיוציטים רק היה potentiated על ידי משאבי אנוש על פני היפוקסיה בלבד תנאים. עלייה זו הייתה בולטת עוד יותר עם הכנסת שני מילימטרים. הריכוז של תאי אנדותל מצופה תוספות שני מילימטר היה titrated ל 25, 000, 50, 000 ו 100, 000 תאים לכל הוספה, בהתאמה.
נמצא כי הגדלת עוצמת התא האנדותל בתרבות המשותפת הובילה להחלשה תלוית מינון של שחרור LDH הנגרמת על ידי משאבי אנוש. עם זאת, לא נראה אפקט כזה בתנאים נורמוקסליים. מתודולוגיית תרבות משותפת זו אינה מוגבלת לתאי אנדותל וקרדיומיוציטים. שיטות אלה אמורות לסייע בחקירה של אינטראקציות תאיות ספציפיות בין קווי תאים מגוונים על פני איברים מרובים של עניין.
