生理条件下猪心的切片和培育

该协议用于在生理条件下切片和培养心脏组织部分六天，可用于急性心脏毒性测试以及心力衰竭疗法的疗效测试。这种培养系统有可能成为急性心脏毒性测试的有力预测人类原位模型，缩小临床前和临床测试结果之间的差距。演示程序将是我们实验室的实验室经理曲庆辉。

要获得猪心组织切片，首先在振动器的组织浴冷却夹克中加入冰，并在浴池中加入Tyrode溶液。使用一升塑料罐收集组织浴冷却夹克中融化的冰径流，将猪心转移到生物安全柜中含有一升新鲜冷心肺溶液的托盘中。使用可伸缩的无菌手术刀解剖心脏以隔离左心室，并使用矩形剃须刀刀片将左心室切成一到两个立方体厘米块。

留出一个组织块进行切片，将剩余的组织块块放入 50 毫升的冷 Tyrode 溶液管中。轻轻按摩保留的组织块，并将一到两滴组织胶水添加到振动器的金属样品支架上。将一块 4% 的 agar 块粘在胶水上，表面面积约一平方厘米，并在胶中加入一到两滴组织胶水。

将心脏块连接到 agar 心脏瓣膜侧向下，组织尽可能平放在支架上，将带心脏块的组织支架放入振动器的切片浴中。至关重要的是，坚持心脏块的阿加与心脏史诗侧朝下在组织胶水，并确保组织是尽可能平坦的。然后将氧气管连接到切片浴和装满 Tyrode 溶液的金属托盘上，将 40 微米细胞过滤器放在金属托盘上，以收集切片时的心脏组织部分。

使用振动器操作软件调整刀片和样品的高度，使刀片靠近组织顶部，但低于心肌和液体覆盖组织和刀片。选择前进以调整开始切片组织的地方。按切片以加快速度，并使用旋钮将刀片向组织边缘移动。

再次按切片以停止并前进以停用进程。然后按指示调整切割参数，然后按切片开始切片组织。当刀片到达组织端，但在到达试样支架的端部之前，再次按切片停止，然后按回，返回以返回开始位置。

当切片达到全长，看起来质量良好时，使用塑料巴氏移液器，用冷Tyrode溶液轻轻地从浴池中收集组织，使用钳子和弹簧剪刀，以脱位切片从心脏时，必要时。将每个收集的切片放在含氧的 Tyrode 浴液中的单个细胞过滤器中，并使用移液器中的溶液将组织压在细胞过滤器表面。然后将金属垫圈放在组织顶部，按住它。

在氧化泰洛德溶液中至少一小时后，修剪每个切片的外部以去除任何不均匀的边缘，将每片的端部粘在一块六毫米宽的消毒聚氨酯打印机正时带上，并配有嵌入的金属线。将支撑的心脏片放入六孔板中，每孔含有六毫升培养介质，并使用无菌钳子确保组织位于井的中心。注意板盖不会接触组织，将板放在培养板上，使板盖的弯曲侧与板的角面匹配，方角向上倾斜。

将切片放入 37 摄氏度和 5% 的二氧化碳培养箱中。以六毫升新鲜含氧培养基代替培养超级钠，每天三次。将盖连接到细胞培养电刺激器并调整刺激器，以连续向心脏片提供 10 伏电力和 1.2 赫兹频率。

插入刺激后，心脏切片将开始跳动。每天中午介质更换时，更换培养皿中的刺激板盖，防止有毒石墨颗粒释放至培养介质中。插入白色泡沫塞，其中用过的盖连接到电缆的细胞培养电刺激器，以防止水损坏电路，并将板盖放入一个浴，辅以2X抗生素/抗霉菌。

第二天，在70%乙醇浴中去污染板盖5至15分钟，然后将盖转移到一个新鲜的自洗水浴中，并辅以2X抗生素/抗霉菌3分钟。冲洗板盖后，使用乙醇喷洒的清洁无绒擦拭，以去除塑料部件中残留的水，并清除白色泡沫塞。然后，盖板准备放回培养板。

使用这种新的仿生培养装置作为证明，猪心脏切片的生存能力保持六天，由MTT测定评估。在头六天，类似于观察到的新鲜心脏切片的反应，在猪心脏切片心肌细胞内没有自发的钙瞬变。心肌细胞确实对外部电和β-肾上腺素刺激有反应。

此外，在心脏切片培养中保持了长达六天的收缩力和对异丙醇的反应，与在新鲜心脏切片中观察到的相似。可以在心脏切片上进行多种结构和功能评估，包括 MTT 可行性测定、免疫污染、电子显微镜、钙瞬态测量、收缩功能评估、代谢评估和分析。我们目前正在使用这种培养系统来测试对猪和人类心脏切片感兴趣的药物和基因疗法的急性心脏毒性和疗效。