Наши результаты показывают, что оптимизация пространственной среды кокультуры эндотелиальных клеток кардиомиоцитов необходима для обеспечения благоприятной модели in vitro для тестирования роли эндотелиальных клеток в защите кардиомиоцитов от моделируемого повреждения репрофузии ишемии. Модели клеточной кокультуры широко использовались для исследования роли клеточно-клеточных взаимодействий в функции и дифференцировке клеток. Тем не менее, раздельное лечение между типами клеток и последующий анализ одного типа клеток не всегда осуществимы в смешанной кокультуре.
Текущее исследование было направлено на создание двух отдельных клеточных слоев со значимым расстоянием между ними, где можно вызвать повреждение репрофузии гипоксией и изучить результат и влияние на один тип клеток. Начните подготовку с размораживания обеих клеточных линий. Обложите ячейки колбами Т25 после промывки их свежими средами.
На следующий день освежите клетки средой и используйте при слиянии. Поддерживайте инкубатор клеточных культур при температуре 37 градусов по Цельсию с 21% кислорода, 5% углекислого газа и 74% азота. Держите его увлажненным.
Оцените слияние клеточных линий кардиомиоцитов под световым микроскопом. Удалите среду из колб, содержащих сливающиеся клеточные культуры, и попробуйте три-пять миллилитров трипсина-ЭДТА на колбу. Осторожно перемешайте колбу и высиживайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух-пяти минут.
После этого оцените ферментативный прогресс под световым микроскопом. После отслоения инактивируют раствор трипсина, добавляя тризин или клеточный раствор в 50-миллилитровую трубку, содержащую 10 миллилитров среды на колбу T25. Центрифугируют клеточную суспензию при 120 х г в течение двух минут до получения мягкой клеточной гранулы.
После центрифугирования удаляют супернатант и повторно суспендируют гранулу в пяти миллилитрах среды. Затем выполните подсчет клеток и подтвердите жизнеспособность клеток. Смешайте и аликвоту из 10 микролитров повторно суспендированных клеток и 10 микролитров трипан-синего красителя, затем подсчитайте живые клетки с помощью счетчика клеток.
Разбавьте клетки свежими обычными средами для достижения желаемой плотности посева. Возьмите 24-луночную пластину, предварительно покройте ее внеклеточным матриксом и пластинчатыми кардиомиоцитами при плотности посева 300 000 на лунку на дно пластины. Поддерживайте клетки на уровне 37 градусов по Цельсию с 5% углекислого газа в течение ночи.
Через 24 часа пластинчатые эндотелиальные клетки вставляют во вставки с оптимальной плотностью покрытия 100 000 на вставку. После 24 часов покрытия эндотелиальных клеток поместите вставки эндотелиальных клеток внутрь колодцев кардиомиоцитов и начните кокультуру. Позвольте клеткам совместно культивировать в течение 12-24 часов перед проведением экспериментов.
Подготовьте гипоксическую среду, налив примерно 25 миллилитров среды в коническую трубку объемом 50 миллилитров. Запечатайте верхнюю часть силиконовой мембраной и используйте стерилизованную пипетку, чтобы пробить отверстие. После этого создайте еще одно отверстие и оставьте примерно 2/3 пипеток погруженными в носитель.
Промывайте среду гипоксическим газом в течение пяти минут со скоростью потока 30 литров в минуту, затем выбрасывайте среду из 24-луночных пластин или культуральных вкладышей, содержащих прикрепленные ячейки. Мойте их очень аккуратно со 100 микролитрами 10% PBS на лунку, добавьте 500 микролитров свежеприготовленной гипоксической среды в каждый колодец пластин или вкладышей. Заменить исходные среды свежими нормальными средами, содержащими глюкозу и сыворотку в нормоксической контрольной группе.
Поместите чашку Петри, наполненную стерильной водой, в камеру гипоксии, чтобы увлажнить камеру. Затем поместите пластины, содержащие гипоксические группы, в камеру. Промывайте гипоксическую камеру гипоксическим газом в течение пяти минут при расходе 30 литров в минуту.
После этого поместите камеру внутри инкубатора при температуре 37 градусов Цельсия на 24 часа. После гипоксии отбросьте старые носители пластин или вкладышей и добавьте 500 микролитров нормальных сред, содержащих глюкозу и сыворотку, к каждой стенке пластин, затем храните пластины внутри инкубатора в нормальных условиях культивирования в течение двух часов, чтобы имитировать реперфузию. Перенесите среду клеточного культуры с 24-луночной пластины в 96-луночную пластину, затем возьмите 200 микролитров среды из каждой лунки 24-луночной пластины и равномерно распределите по четырем скважинам 96-луночной пластины.
Измерьте абсорбцию ЛДГ с помощью набора для анализа цитотоксичности в 96-луночной пластине и следуйте инструкциям производителя для определения степени повреждения клеток. В этом исследовании оценивались три типа вкладышей. Все три вставки имели одинаковый размер пор 0,4 микрометра.
Единственным отличием между ними была вставка до высоты основания, позволяющая расстояниям между двумя совместно культивируемыми слоями клеток составлять 0,5, 1,0 и 2,0 миллиметра. Используя этот протокол, клетки культивировали в нормальных кислородных условиях, а затем разделили на две группы: нормоксическую контрольную группу и группу гипоксии. Через 24 часа обе группы обновляли средой и культивировали в нормальных кислородных условиях еще два часа, прежде чем проводить анализы конечных точек.
Сравнение трех типов культуральных вставок при оценке высвобождения лактатдегидрогеназы только для кардиомиоцитов, только эндотелиальных клеток и кокультуры кардиомиоцитов с эндотелиальными клетками показано здесь в условиях нормоксической, гипоксии и гипоксигенации. При расстоянии 0,5 миллиметра между клеточными слоями гипоксия привела к значительному увеличению высвобождения ЛДГ по сравнению с нормоксией, когда кардиомиоциты культивировались в одиночку. Тем не менее, ЛДГ был лишь незначительно повышен в группе реоксигенации гипоксии по сравнению с группой только гипоксии.
Когда эндотелиальные клетки и кардиомиоциты совместно культивировали вместе, увеличение высвобождения ЛДГ только в условиях гипоксии не ослаблялось. Это указывает на то, что эндотелиальные клетки не оказывали никакого защитного эффекта по сравнению с группой кардиомиоцитов в условиях только гипоксии. Тем не менее, эндотелиальные клетки оказывали мягкую, но значительную защиту на кардиомиоциты во время ЧСС. Когда расстояние между клеточными слоями составляло один миллиметр, высвобождение ЛДГ также значительно увеличивалось в кардиомиоцитах только при условии гипоксии.
Однако, в отличие от 0,5-миллиметровой вставки, увеличение ЛДГ в кардиомиоцитах потенцировалось только ЧСС над состояниями гипоксии. Это увеличение было еще более выраженным с двухмиллиметровой вставкой. Концентрацию эндотелиальных клеток, покрытых двумя миллиметровыми вставками, титровали до 25 000, 50 000 и 100 000 клеток на вставку соответственно.
было установлено, что увеличение интенсивности эндотелиальных клеток в кокультуре приводило к дозозависимому ослаблению высвобождения ЛДГ, вызванному ЧСС. Однако в нормоксических условиях такого эффекта не наблюдалось. Эта методология кокультурирования не ограничивается эндотелиальными клетками и кардиомиоцитами. Эти методы должны помочь в исследовании специфических клеточных взаимодействий между различными клеточными линиями в нескольких органах, представляющих интерес.
