小儿弥漫性中线胶质瘤的活-3D细胞免疫细胞化学测定

弥漫性中线胶质瘤是一种高度浸润的脑肿瘤。该方法有助于实时研究DMG细胞如何在3D环境中迁移和侵袭，并具体了解关键粘附分子的潜在作用。通过使用标记试剂和特异性抗CD44抗体，我们可以通过活细胞成像来研究CD44在DMG细胞质膜上的表达，也可以在3D迁移和侵袭中。

该技术的应用突出了CD44在这些细胞运动中的潜在作用，表明它可能代表一个有价值的侵入性分子靶标。首先，通过加入 100 微升无菌水来重新水化 ALR，并通过移液混合溶液。将抗体与TSM培养基中的ALR混合在圆底多孔板或琥珀色管中，并保护其免受光照。

准备足够量的培养基，以最终测定浓度的三倍每孔分配25微升，然后在室温下孵育15分钟。在TSM培养基中以1.5毫摩尔浓度稀释BSR，以在测定结束时获得0.5毫摩尔的终浓度。然后轻轻地慢慢地从每个孔中取出 75 微升培养基，避免接触 NS 所在的孔底部并目视检查 NS 的存在。

向每个孔中轻轻加入 25 微升 BSR 和 ALR 抗体复合物，让 ALR 抗体复合物与培养基混合两到三分钟。使用倒置显微镜，确保每个NS位于孔底部的中心。通过使用针头去除气泡来避免气泡的形成。

将盘子放在冰上五分钟，让盘子底部变冷。通过将预冷的P200尖端放在井的内壁上，每孔分配75微升BMM，避免形成气泡并接触孔底。将盘子放在冰上五分钟，让 BMM 与培养基混合。

使用倒置显微镜检查NS的位置。如果不集中存在，请将板在 4 摄氏度下以 180 倍 G 离心五分钟。然后将板转移到活细胞分析仪器中，置于37摄氏度，5%二氧化碳和95%湿度的培养箱内。一旦孔涂上BMM，切割P200尖端。

从每个选定的孔中取出50微升细胞培养基和NS，并将其转移到包被的平底孔中。目视检查NS在每个孔中的存在和位置。向每个孔中轻轻加入50微升稀释的BSR和ALR抗体，等待两到三分钟让试剂混合。

并使用倒置显微镜，确保大多数复制的NS位于孔的中心。确保没有任何气泡后，如前所述，在活细胞分析仪器中轻轻转移板。在活细胞分析仪器软件上，选择要获取的选项计划，然后单击加号选项卡并选择按计划扫描以按文本手稿中提到的间隔扫描板。

在软件窗口中，创建或恢复船只，然后单击选项新建。选择球体扫描类型、相位加明场、用于侵袭测定的绿色图像通道和4X物镜。选择稀释克隆扫描，键入4X物镜，并进行相和绿色迁移测定。

选择板类型并通过在板图上突出显示要扫描的孔来定义要扫描的孔，然后设置扫描频率。单击添加到计划并开始扫描。选择"创建新分析定义"选项卡。

然后在选项卡上分别选择球体侵入或基本分析仪应用程序进行入侵和迁移。在镜像通道中选择适合入侵和迁移的通道。从三到四个孔中选择一些具有代表性的图像，以预览和优化分析设置。

对于侵袭测定，在分析定义选项卡中，使用文本手稿中提到的设置调整明场和绿色通道中的应用设置，以在球状体和入侵细胞之间生成精确的分割。对于迁移测定，如文本手稿中提到的相位和绿色通道调整应用设置，以在汇合细胞和绿色细胞之间生成精确的分割。通过随机单击多个孔来检查NS的分析设置是否正确。

选择要分析的井和时间点。保存分析定义，然后单击完成。CD44在原发性DMG患者来源细胞中表达的代表性免疫荧光共聚焦图像证明了CD44在细胞迁移和侵袭中的作用。

活体3D细胞免疫化学允许可视化CD44表达。迁移和侵袭延时的代表帧显示了随着时间的推移观察到的同一细胞上绿色荧光信号的存在和不存在，表明CD44的表达在细胞迁移和入侵时是开和关的。迁移和侵袭过程被跟踪超过96小时，显示QCTB-R059细胞具有高水平的CD44。

CD44表达的定量及其随时间的增加是通过与ALR相关的迁移和侵袭的总体绿色荧光信号来测量的。当抗CD44抗体用于活细胞时，它会影响细胞形态，诱导从间充质样到变形虫样侵袭的转变，并降低这些细胞的侵袭和迁移能力。该方法最关键的步骤是将标记试剂与抗体混合，将混合物添加到基质胶和培养基中，以及访问活细胞成像仪器。

该方法可以通过使用两种或两种以上独特的标记试剂和抗体来研究由直接细胞和接触介导的DMG细胞相互作用来进一步实现。我们的方法为3D研究DMG迁移和侵袭的细胞和分子机制提供了新的工具，为抑制其浸润表型提供了新的方向。