三维类器官和球状体模型的染色和高分辨率成像

以细胞和亚细胞分辨率表征3D体外模型对于充分开发至关重要，但可能具有挑战性。因此，我们为固定3D体外模型的染色和亚细胞分辨率成像提供了补充方案，范围从100微米到几毫米。3D 结构是径向的，应小心操作。

移液前，请检查管内3D结构的位置，以避免任何误吸。由于我们已经将经典技术用于嵌入类器官或微球等小结构，因此可视化指令可以帮助首次用户更轻松地执行任务。与我一起演示该程序的是来自病理学研究平台的实验室技术人员Laura Francols。

要制备用于 3D 全封口染色的样品，请使用预编码有 BSA 的一毫升移液器吸头将一毫升 3D 结构悬浮液添加到 500 微升 PBS 管中。当3D结构沉降到管底部时，小心地用500微升透化封闭溶液替换PBS，在室温下以每分钟30至50转的速度温和水平搅拌孵育一小时。在孵育结束时，让3D结构再次沉淀，然后在一毫升补充有BSA的0.1%PBS中仔细洗涤3D结构两次，每次洗涤三分钟。

最后一次洗涤后，用 250 微升 PBS 中的一抗标记 3D 结构两到三天，并在 4 摄氏度下轻轻水平搅拌。在孵育结束时，用五次三分钟和两次15分钟的洗涤在一毫升0.1%PBS BSA中洗涤样品。最后一次洗涤后，用 250 微升 PBS 中的适当二抗在 4 摄氏度下标记 3D 结构 24 小时，并轻轻水平搅拌避光。

第二天，用250微升适当浓度的Hoechst 3342标记3D结构，在4摄氏度下温和水平搅拌孵育两小时。在孵育结束时，如图所示，在每次洗涤一毫升PBS中洗涤3次3分钟和2次，每次洗涤15分钟。最后一次洗涤后，将3D结构转移到96孔黑色聚苯乙烯微孔板上，并在结构上轻轻加入200微升的透明溶液，避免气泡。

然后将用铝箔覆盖的板放在 4 摄氏度下至少 48 小时。要嵌入大型3D细胞培养模型，请使用BSA涂层的一毫升移液器吸头小心地将3D结构转移到带有PTFE衬里瓶盖的平底玻璃管中。结构稳定后，小心地用70%乙醇替换PBS，在室温下孵育30分钟。

在孵育结束时，用一毫升即用型伊红Y溶液替换70%乙醇。轻弹试管并染色结构至少 30 分钟。在孵育结束时，每次洗涤一毫升100%乙醇中连续洗涤三次30分钟使结构脱水。

最后一次脱水后，在化学罩下每次洗涤一毫升二甲苯中连续洗涤三次 30 分钟，清除 3D 结构。最后一次二甲苯浸泡后，将一块二甲苯浸泡过的活检垫放入白色微孪生组织盒的一个隔室中，并使用BSA涂有两毫升塑料巴斯德移液管将3D结构转移到垫上。用另一个浸泡过的二甲苯活检垫覆盖 3D 结构，以将 3D 结构固定到位并关闭暗盒。

转移所有样品后，将盒式磁带放入65摄氏度的石蜡浴中30分钟，然后将暗盒放入新鲜的65摄氏度石蜡浴中过夜。第二天早上，将液体石蜡添加到每个样品一个65摄氏度的加热包埋模具中，并将一个石蜡包埋样品放入每个模具中。轻轻搅拌模具，直到所有3D结构下降到底部，并使用65摄氏度加热的细钳将3D结构定位在每个模具的中心。

冷却模具，直到石蜡形成一层薄薄的固体层，将 3D 结构固定到位。放置一个纸巾盒，在模具上加入热石蜡。当石蜡完全凝固时取出模具。

要嵌入小型3D细胞培养模型，每次洗涤时在1毫升TBS中轻轻洗涤3D结构三次。最后一次洗涤后，在不接触结构的情况下尽可能多地去除TBS，并从商业石蜡包埋试剂盒中加入两滴试剂。轻敲轻轻混合，加入两滴试剂，一滴轻拍，直到凝胶凝固。

使用细镊子从试剂盒的预组装盒孔中转移凝胶，并如图所示在通风橱中用30分钟的升序乙醇和二甲苯孵育使凝胶包埋样品脱水。最后一次二甲苯浸泡后，将暗盒放入65摄氏度的石蜡浴中过夜，然后使用细镊子将石蜡包埋样品转移到装有65摄氏度的液体石蜡包埋模具的中心。然后用另一层石蜡固定3D结构，如大型3D细胞培养模型所示。

三维全安装染色和共聚焦显微镜可提供有关3D培养模型的细胞组成和空间位置的视觉信息，深度可达200微米。使用该协议可以获得的3D结构的高分辨率允许应用细胞和亚细胞分割算法来量化细胞数量并检测不同细胞亚型中的各种细胞标志物。3D 整体安装分析可应用于深度达 200 微米的可视化细胞，无论整体结构如何。

相反，2D 切片分析可以提供对任何大小的细胞的洞察。