二维细胞培养不能充分模仿体内肿瘤的生长。为了改进，3D 程序已经开发使用球形。我们的3D胶质母细胞瘤球类检测特别适合研究脑肿瘤进入健康脑肿瘤环境。

三维培养模型可用于概括肿瘤的多细胞结构、异质性和代谢状态，从而对药物效应进行更严格的评估。确保不要触摸井底或完全去除上清液，将凝胶留在冰上，并迅速将细胞添加到凝胶中。要生成大小均匀的肿瘤球体，首先用5毫升PBS清洗感兴趣的肿瘤细胞培养，用0.5至1毫升分离酶治疗细胞。

在37摄氏度下5分钟后，停止使用4至4.5毫升PBS的反应，将分离的细胞转移到含有10毫升完整生长介质的15毫升圆锥管中。计数后，每8毫升完全生长介质的1倍10至6细胞重新悬浮细胞，辅以2%甲基纤维素浓度的两毫升，将悬浮液转移到无菌系统容器中。然后将100微升的细胞加入96井圆形底板的每个井中，并将该细胞放入37摄氏度5%的二氧化碳培养箱中，为期三至四天。

进行入侵测定，当肿瘤细胞形成大小均匀的球类时，将每个细胞结构转移到500微升管中，用200微升PBS洗涤球体一次。第二次洗涤后，小心地将球体转移到100微升新鲜准备的胶原蛋白基质中，并将每个球体悬浮液添加到平底96井板的每个井的中心。在37摄氏度下孵育30分钟后，在每一井的凝胶顶部加入100微升完全生长介质。

一定要把所有的球体放在每一个井的中心，以最好的成像肿瘤细胞入侵。为了进行迁移测定，当肿瘤细胞形成大小均匀的球状体时，在37摄氏度下，在生长介质中涂上每毫升Matrigel0.2毫克的六井板，30分钟。在孵育结束时，取出马特里格尔，并添加两毫升的完全生长介质到每一个井。

将球体从50微升体积的圆形底板转移到六孔板的单个孔中，并放入细胞培养箱24小时。第二天，在37摄氏度下，用每毫升10毫微克的球状物染色30分钟。在入侵或迁移分析后进行图像采集时，请将板放在配备摄像机的 Brightfield 共合一显微镜的舞台上，并在适当的实验期间获取图像。

要以半自动方式分析图像，请将图像导入斐济，然后单击插件、宏、交互式解释器。复制并粘贴适应的紫色循环。保留紫色句子，并根据需要添加感兴趣的绿色句子。

然后，要测量每个球体的面积，请单击"分析和测量"。为了测量球形结构不同区域的缺氧，可以使用碳氢化物IX染色来确定缺氧活性。在这个具有代表性的分析中，在球体中心观察到更多的碳氢化物IX阳性细胞。

位于球状核中的低氧细胞往往比核心周围的细胞更糖解。线粒体可以通过电子显微镜进行成像，以作进一步分析。球体直径与组成 3D 细胞结构的细胞密度直接相关，斐济宏可用于量化每个球体内的细胞的增殖、入侵或迁移，或每个球体内的细胞迁移。

球体核心的增加反映了细胞增殖的刺激。线粒体呼吸链的复杂 I 抑制后，线粒体中绝大多数 ATP 生产在 72 小时后减少增殖 20%。氯化氢处理可增强胶原蛋白 I 型入侵在 24 小时内，但与控制未经处理的球类相比，球类的迁移面积减少了 1.5 倍。

根据实时成像评估，球体表现出高内部动力学并快速移动。球体的大小应相对均匀，应注意将球体操纵到井的中心，以获得最佳成像效果。该方法还可用于研究肿瘤细胞增殖、迁移和死亡，以及细胞外基质、细胞受体或细胞内蛋白质的表达。

球体也可以封装，并在去除胶囊时研究细胞表面张力增加的影响。