DetectSyn:一种快速、无偏倚的荧光方法，用于检测突触密度的变化

DetectSyn利用接近连接测定技术来快速识别突触的变化。我们还提供了一个协议来分析结果。DetectSyn的主要优点是在可以分析的大面积组织中获得结果的速度有多快。

首先，用塑料巴斯德移液器小心地去除封闭溶液，而不会干扰细胞。然后在大型塑料培养皿上放上Parafilm。并使用镊子，小心地将盖玻片转移到Parafilm上。

在盖玻片的顶部加入60微升的一抗溶液，确保抗体溶液不会溢出盖玻片的侧面。为了提供湿度并防止样品在孵育过程中变干，将超纯水添加到较小的培养皿中，并小心地将培养皿放在盖玻片周围。然后覆盖较大的培养皿，并在室温下将培养的细胞孵育一小时。

与一抗一起孵育后，使用镊子小心地从盖玻片上轻拍一抗溶液，然后将其盖玻片转移到填充有500微升PBS的原始24孔板上。然后用PBS洗涤样品三次，每次10分钟，并在轨道振荡器上轻轻搅拌。最后一次洗涤后，将盖玻片移回大培养皿中，并在盖玻片的顶部加入40微升的二抗溶液。

盖上培养皿，将样品在37摄氏度下孵育一小时。对于连接，在将连接酶保持在冷块上的同时，使用连接液稀释连接酶1至40，并立即将40微升连接酶混合物添加到盖玻片中。盖上培养皿，将样品在37摄氏度下孵育30分钟。

对于扩增，使用扩增储液在冷块上稀释聚合酶1280。然后将40微升扩增混合物加入盖玻片中，并在37摄氏度下将样品孵育100分钟。接下来，为了进行安装，将三微升的安装介质滴到载玻片上。

从盖玻片上轻敲多余的洗涤缓冲液，然后将盖玻片与细胞面朝下放入安装介质中。用少量透明指甲油密封侧面，以将盖玻片固定到位。对于切片组织的安装，小心地将纸巾片转移到准备好的载玻片上并将其平放。

然后将5至10微升的安装培养基滴到组织切片上。如前所述，将玻璃盖玻片放在组织切片上，并用透明指甲油密封盖玻片。对于使用共聚焦显微镜进行数字成像，请调整每个荧光通道的增益、偏移和激光功率，以降低背景噪声并增强荧光信号。

确保荧光信号不会过饱和。对于培养神经元，在"ND 采集"选项卡下，单击"保存到文件"。然后在"浏览"下，选择要保存图像的文件并输入文件名。

接下来，在 Z 选项卡下，选择"由范围定义的对称模式"选项。将焦点设置为最佳双平面贴图，然后单击相对按钮将此焦平面设置为 z 堆栈的中间。接下来，将范围设置为五微米，步长为一微米，并选中Z移动时关闭活动快门。

在"波长"选项卡下，在"光学配置"下，使用先前配置的采集设置选择光学按钮的名称，然后单击"立即运行"。对于切片组织，从采集菜单中选择扫描大图像，然后在捕获面板下，选择具有先前配置的采集设置的光学按钮。此外，在此面板中选择正确的物镜。

接下来，在区域面板和目视点下，使用箭头键设置感兴趣区域或 ROI 的边界。然后单击"将大图像保存到文件"并为图像创建保存路径文件名。最后，在设置面板下，确保选中"多通道捕获"。

然后在光学配置下选择具有先前配置的采集设置的光学按钮的名称。在 ImageJ 中，打开阈值选项，方法是转到图像菜单，单击"调整"，然后单击"阈值"。如果图像具有深色背景，请选择"深色背景"选项。

接下来，根据先前确定的优化阈值设置调整阈值的上限和下限，然后单击"应用"。对于培养的细胞，使用MAP2通道和自由手ROI工具为每个神经元（包括树突和体细胞）绘制ROI。对于切片组织，在封装感兴趣区域的切片图像中绘制一个空闲的 ROI。

然后，通过打开"分析"菜单并单击"度量"来获取 ROI 区域。要检测每个 ROI 中的 punta 数量，请使用自动检测工具，如粒子分析。从"已分析"菜单中，选择"分析的颗粒"并定义点滴管尺寸直径。

接下来，从显示下拉菜单中选择"叠加蒙版"选项，然后选中"显示结果"选项并单击"确定"。要将平点数除以单个 ROI 的面积，请将弹出结果中每个图像的结果复制并粘贴到电子表格中。确定从哪个文件和样本中获取数据，并将 ROI 的面积除以 punta 的数量。

最后，将结果归一化为对照样品，对对照样品的结果进行平均，并将所有样品的结果除以对照的平均值。GABAB激动剂巴氯芬是快速抗抑郁药Ro-256981的体外疗效所必需的。突触形成的增加通过白色蓬塔的增加来证明。

没有巴氯芬，看不到突触形成的增加。在体内，腹膜内注射快速抗抑郁药导致与盐水对照相比突触形成的增加。虽然一些平底鸟出现在技术控制图像中，但与其他面板中的大平底鸟相比，它们的大小通常与白色规格所显示的尺寸不同。

此外，这些punta与soma中出现的一些punta所证明的位置不同。DetectSyn可以识别由于疾病状态或药物治疗引起的突触变化。这种方法可以帮助为研究影响突触发育或分解的疾病的疾病的任何研究领域提供见解。