DetectSyn использует преимущества технологии бесконтактного лигирования для быстрого выявления изменений в синапсах. Мы также предоставляем протокол для анализа результатов. Основным преимуществом DetectSyn является то, как быстро результаты могут быть получены в больших областях ткани, которые могут быть проанализированы.
Для начала осторожно удалите блокирующий раствор пластиковой пипеткой Пастера, не нарушая клетки. Затем выровняйте большую пластиковую чашку Петри Парафильмом. А с помощью щипцов аккуратно перенесите крышку скользящих на Парафильм.
Добавьте 60 микролитров раствора первичного антитела в верхнюю часть крышки, гарантируя, что раствор антител не прольется по бокам крышки. Чтобы обеспечить влажность и предотвратить высыхание образцов во время инкубации, добавьте сверхчистую воду в меньшую чашку Петри и аккуратно поместите чашку вокруг крышки. Затем накройте большую чашку Петри и инкубируйте культивируемые клетки в течение одного часа при комнатной температуре.
После инкубации с первичным антителом используйте щипцы, чтобы осторожно отстукивать раствор первичного антитела от крышки на бумажное полотенце и переносить крышку на их оригинальную 24-луночную пластину, заполненную 500 микролитрами PBS. Затем промывайте образцы PBS три раза в течение 10 минут каждый с легким перемешиванием на орбитальном шейкере. После последней стирки переложите крышку обратно в большую чашку Петри и добавьте 40 микролитров раствора вторичного антитела в верхнюю часть крышки.
Накройте чашку Петри и высиживайте образцы при температуре 37 градусов цельсия в течение одного часа. Для лигирования, удерживая лигазу на холодной блокаде, разбавьте лигазу от 1 до 40 с помощью лигационного бульона и сразу же добавьте 40 микролитров смеси лигазы в крышку слипов. Накройте чашку Петри и инкубируйте образцы при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут.
Для усиления разбавляют полимеразу 1280 на холодном блоке с помощью амплификационного запаса. Затем добавьте 40 микролитров смеси для усиления в крышку и инкубируйте образцы в течение 100 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Затем для монтажа опустите три микролитра монтажного носителя на слайд.
Отсоедините лишний буфер промывки от крышки и поместите крышку с ячейками вниз в монтажный носитель. Запечатайте боковые стороны небольшим количеством прозрачного лака для ногтей, чтобы удерживать крышку на месте. Для крепления нарезанной ткани аккуратно перенесите срез ткани на подготовленный слайд и уложите его ровно.
Затем опустите от 5 до 10 микролитров монтажной среды на срез ткани. Поместите стеклянную крышку поверх среза ткани и запечатайте крышку прозрачным лаком для ногтей, как показано ранее. Для цифровой визуализации с помощью конфокального микроскопа отрегулируйте коэффициент усиления, смещение и мощность лазера для каждого флуоресцентного канала, чтобы уменьшить фоновый шум и усилить флуоресцентный сигнал.
Убедитесь, что флуоресцентный сигнал не перенасыщен. Для нейронов культуры на вкладке ND Acquisition нажмите кнопку Сохранить в файл. Затем в разделе Обзор выберите файл для сохранения изображения и введите имя файла.
Затем на вкладке Z выберите параметр Симметричный режим, определяемый диапазоном. Установите фокус на лучшую двухплоскостную карту и нажмите кнопку Relative, чтобы установить эту фокальную плоскость в качестве середины z-стека. Затем установите диапазон в пять микрометров с одним шагом микрометра и установите флажок Закрыть активный затвор во время движения Z.
На вкладке Длина волны выберите имя оптической кнопки с ранее настроенными параметрами сбора в разделе Оптическая конфигурация и нажмите кнопку Выполнить сейчас. Для разрезанной ткани в меню «Получить» выберите «Сканировать большое изображение», затем под панелью захвата выберите оптическую кнопку с ранее настроенными параметрами сбора. Кроме того, выберите правильную цель на этой панели.
Затем под панелью области и окуляром используйте клавиши со стрелками, чтобы установить границы интересующей области или рентабельности инвестиций. Затем нажмите «Сохранить большое изображение в файл» и создайте имя файла пути к сохранению для изображения. Наконец, на панели настройки убедитесь, что установлен флажок Многоканальный захват.
Затем выберите имя оптической кнопки с ранее настроенными параметрами сбора данных в разделе Оптическая конфигурация. В ImageJ откройте параметр порогового значения, перейдя в меню изображения, щелкнув Настроить, а затем Порог. Выберите параметр «Темный фон», если изображение имеет темный фон.
Затем отрегулируйте верхнюю и нижнюю границы порога в соответствии с ранее определенными оптимизированными настройками порога и нажмите «Применить». Для культивируемых клеток используйте канал MAP2 и инструмент ROI свободной руки, чтобы нарисовать ROI для каждого нейрона, включая дендриты и сому. Для нарезанной ткани нарисуйте свободную окупаемость инвестиций в изображение среза, которая инкапсулирует интересующую область.
Затем получите область ROI, открыв меню «Анализ» и нажав «Мера». Чтобы определить количество пунт в каждом ROI, используйте автоматический инструмент обнаружения, такой как анализ частиц. В меню Анализируемые выберите Анализируемые частицы и определите диаметр размера пункты.
Затем в раскрывающемся меню «Показать» выберите опцию «Наложенные маски», затем отметьте опцию «Отображать результаты» и нажмите «ОК». Чтобы разделить количество пунт на область отдельной рентабельности инвестиций, скопируйте и вставьте результаты для каждого изображения из всплывающего окна результатов в электронную таблицу. Определите, из какого файла и выборки получены данные, и разделите площадь ROI на количество пунт.
Наконец, для нормализации результатов для контрольных образцов усредняют результаты по контрольным образцам и делят полученные результаты всех образцов на среднее значение контрольного образца. Агонист GABAB, баклофен, необходим для эффективности in vitro быстрого антидепрессанта Ro-256981. Увеличение образования синапсов демонстрируется увеличением белого пунта.
Без баклофена увеличения образования синапсов не наблюдается. In vivo внутрибрюшинное введение быстрого антидепрессанта приводит к увеличению образования синапсов по сравнению с физиологическим контролем. В то время как некоторые пунты появляются на изображениях технического контроля, они, как правило, не такого размера, как показано белой спецификацией по сравнению с большой пунтой на других панелях.
Кроме того, эти пунты находятся не в том же месте, как показывают некоторые пунты, появляющиеся в соме. DetectSyn может выявлять изменения синапсов из-за болезненного состояния или медикаментозного лечения. Этот метод может помочь дать представление о любой области исследований, которая изучает расстройства, влияющие на развитие или разрушение синапсов.
