DetectSyn sfrutta la tecnologia di analisi della legatura di prossimità per identificare rapidamente le modifiche alle sinapsi. Forniamo anche un protocollo per analizzare i risultati. Il vantaggio principale di DetectSyn è la rapidità con cui i risultati possono essere ottenuti nelle grandi regioni di tessuto che possono essere analizzate.
Per iniziare, rimuovere con attenzione la soluzione bloccante con una pipetta Pasteur di plastica senza disturbare le cellule. Quindi foderare una grande capsula di Petri di plastica con Parafilm. E usando la pinza, trasferire con cura le scivolate di copertura sul Parafilm.
Aggiungere 60 microlitri della soluzione anticorpale primaria nella parte superiore dello slip di copertura, assicurandosi che la soluzione anticorpale non si rovesci sui lati dello slip di copertura. Per fornire umidità ed evitare che i campioni si secchino durante l'incubazione, aggiungere acqua ultrapura a una capsula di Petri più piccola e posizionare con cura il piatto attorno agli scivoli di copertura. Quindi coprire la capsula di Petri più grande e incubare le cellule coltivate per un'ora a temperatura ambiente.
Dopo l'incubazione con l'anticorpo primario, utilizzare una pinza per estrarre con cura la soluzione anticorpale primaria dal coperchio scivola su un tovagliolo di carta e trasferire i foglietti di copertura sulla loro piastra originale a 24 pozzetti riempita con 500 microlitri di PBS. Quindi lavare i campioni con PBS tre volte per 10 minuti ciascuno con una leggera agitazione su uno shaker orbitale. Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire il coperchio scivola di nuovo nella grande capsula di Petri e aggiungere 40 microlitri della soluzione anticorpale secondaria nella parte superiore dello slip di copertura.
Coprire la capsula di Petri e incubare i campioni a 37 gradi Celsius per un'ora. Per la legatura, mantenendo la ligasi su un blocco freddo, diluire la ligasi da 1 a 40 usando il calcio di legatura e aggiungere immediatamente 40 microlitri del mix di ligasi alle scivolate di copertura. Coprire la capsula di Petri e incubare i campioni a 37 gradi Celsius per 30 minuti.
Per l'amplificazione, diluire la polimerasi 1280 su un blocco freddo utilizzando il materiale di amplificazione. Quindi aggiungere 40 microlitri della miscela di amplificazione agli scivoli di copertura e incubare i campioni per 100 minuti a 37 gradi Celsius. Successivamente, per il montaggio, rilasciare tre microlitri di supporto di montaggio su una diapositiva.
Togliere il tampone di lavaggio in eccesso dallo slip del coperchio e posizionare lo slip del coperchio con le celle rivolte verso il basso nel supporto di montaggio. Sigillare i lati con una piccola quantità di smalto trasparente per mantenere il coperchio in posizione. Per il montaggio di tessuto affettato, trasferire con cura una fetta di tessuto sul vetrino preparato e appoggiarla in piano.
Quindi far cadere da 5 a 10 microlitri di supporto di montaggio sulla fetta di tessuto. Posizionare un coperchio di vetro scivolare sopra la fetta di tessuto e sigillare il coperchio con smalto trasparente, come dimostrato in precedenza. Per l'imaging digitale con un microscopio confocale, regolare il guadagno, l'offset e la potenza laser per ciascun canale fluorescente per ridurre il rumore di fondo e migliorare il segnale fluorescente.
Assicurarsi che il segnale fluorescente non sia troppo saturo. Per i neuroni di coltura, nella scheda Acquisizione ND, fare clic su Salva su file. Quindi, in Sfoglia, scegli un file per salvare l'immagine e inserisci il nome del file.
Quindi, nella scheda Z, selezionare l'opzione Modalità simmetrica definita dall'intervallo. Impostare la messa a fuoco sulla migliore mappa a due piani e fare clic sul pulsante Relativo per impostare questo piano focale come centro dello z-stack. Quindi, impostare l'intervallo su cinque micrometri con passi di un micrometro e selezionare Chiudi otturatore attivo durante il movimento Z.
Nella scheda Lunghezza d'onda, selezionare il nome del pulsante ottico con le impostazioni di acquisizione configurate in precedenza in Configurazione ottica e fare clic su Esegui ora. Per il tessuto affettato, dal menu acquisizione scegliere Scansione immagine di grandi dimensioni, quindi sotto il pannello di acquisizione, selezionare il pulsante ottico con le impostazioni di acquisizione configurate in precedenza. Inoltre, selezionate l'obiettivo corretto in questo pannello.
Successivamente, sotto il pannello dell'area e l'oculare, utilizzare i tasti freccia per impostare i confini della regione di interesse o del ROI. Quindi fare clic su Salva immagine di grandi dimensioni su file e creare un nome di file di percorso di salvataggio per l'immagine. Infine, sotto il pannello di configurazione, assicurarsi che l'acquisizione multicanale sia selezionata.
Quindi scegliere il nome del pulsante ottico con le impostazioni di acquisizione precedentemente configurate in configurazione ottica. In ImageJ, apri l'opzione di soglia andando al menu immagine, facendo clic su Regola, quindi su Soglia. Scegli l'opzione Sfondo scuro se l'immagine ha uno sfondo scuro.
Quindi, regolare i limiti superiore e inferiore della soglia per le impostazioni di soglia ottimizzate precedentemente determinate e fare clic su Applica. Per le cellule coltivate, utilizzare il canale MAP2 e uno strumento ROI a mano libera per disegnare un ROI per ciascun neurone, inclusi dendriti e soma. Per il tessuto affettato, disegna un ROI a mano libera all'interno dell'immagine della sezione che incapsula l'area di interesse.
Quindi ottenere l'area del ROI aprendo il menu Analizza e facendo clic su Misura. Per rilevare il numero di punti all'interno di ciascun ROI, utilizzare uno strumento di rilevamento automatico come l'analisi delle particelle. Dal menu Analizzato ,Analyzed), selezionate Particelle analizzate (Analyzed Particles) e definite il diametro della dimensione del punto.
Successivamente, dal menu a discesa Mostra, scegli l'opzione Maschere sovrapposte, quindi seleziona l'opzione Visualizza risultati e fai clic su OK. Per dividere il numero di punta per l'area del singolo ROI, copia e incolla i risultati per ogni immagine dai risultati pop-up in un foglio di calcolo. Identifica da quale file e campionare i dati da cui siamo ottenuti e dividi l'area del ROI per il numero di punta.
Infine, per normalizzare i risultati ai campioni di controllo, calcolare la media dei risultati per i campioni di controllo e dividere i risultati ottenuti di tutti i campioni per la media del controllo. L'agonista GABAB, baclofen, è necessario per l'efficacia in vitro dell'antidepressivo rapido Ro-256981. Un aumento della formazione di sinapsi è dimostrato da un aumento della punta bianca.
Senza baclofene, non si osserva alcun aumento della formazione di sinapsi. In vivo, l'iniezione intraperitoneale dell'antidepressivo rapido provoca un aumento della formazione di sinapsi rispetto al controllo salino. Mentre alcuni punta appaiono nelle immagini di controllo tecnico, generalmente non hanno le stesse dimensioni dimostrate dalle specifiche bianche rispetto alla grande punta negli altri pannelli.
Inoltre, queste punte non si trovano nella stessa posizione, come dimostrato da qualche punta che appare all'interno del soma. DetectSyn può identificare i cambiamenti alle sinapsi dovuti a uno stato di malattia o a un trattamento farmacologico. Questo metodo può aiutare a fornire informazioni a qualsiasi area di ricerca che studia i disturbi che influenzano lo sviluppo o la rottura delle sinapsi.
