DetectSyn은 근접 결찰 분석 기술을 활용하여 시냅스의 변화를 신속하게 식별합니다. 우리는 또한 결과를 분석하기위한 프로토콜을 제공합니다. DetectSyn의 주요 장점은 분석 할 수있는 조직의 큰 영역에서 결과를 얼마나 빨리 얻을 수 있는지입니다.
시작하려면 세포를 방해하지 않고 플라스틱 파스퇴르 피펫으로 블로킹 용액을 조심스럽게 제거하십시오. 그런 다음 파라 필름으로 큰 플라스틱 페트리 접시를 줄 지어 라. 포셉을 사용하여 커버 슬립을 파라 필름으로 조심스럽게 옮깁니다.
60 마이크로리터의 일차 항체 용액을 커버 슬립의 상부에 첨가하여, 항체 용액이 커버 슬립의 측면 위로 유출되지 않도록 한다. 습도를 제공하고 배양 중에 샘플이 건조되는 것을 방지하려면 더 작은 페트리 접시에 초순수를 넣고 조심스럽게 덮개 슬립 주위에 접시를 놓습니다. 그런 다음 더 큰 페트리 디쉬를 덮고 배양된 세포를 실온에서 한 시간 동안 인큐베이션한다.
일차 항체와 함께 인큐베이션한 후, 포셉을 사용하여 커버 슬립에서 일차 항체 용액을 종이 타월 상에 조심스럽게 탭핑하고 커버 슬립을 500 마이크로리터의 PBS로 채워진 원래의 24-웰 플레이트로 옮긴다. 그 후 PBS로 샘플을 10분 동안 세 번 세척하고 오비탈 쉐이커 상에서 부드럽게 교반시킨다. 마지막 세척 후, 커버 슬립을 다시 큰 페트리 접시로 옮기고 40 마이크로 리터의 보조 항체 용액을 커버 슬립의 상단에 첨가하십시오.
페트리 접시를 덮고 샘플을 섭씨 37도에서 한 시간 동안 배양하십시오. 라이게이션을 위해, 리가아제를 차가운 블록 상에 유지하면서, 라이게이션 스톡을 사용하여 리가아제 1 내지 40을 희석하고, 즉시 40 마이크로리터의 리가아제 믹스를 커버 슬립에 첨가한다. 페트리 접시를 덮고 샘플을 섭씨 37도에서 30분 동안 인큐베이션한다.
증폭을 위해, 증폭 스톡을 사용하여 차가운 블록 상에 중합효소(1280)를 희석한다. 이어서, 증폭 믹스 40 마이크로리터를 커버 슬립에 첨가하고, 샘플을 섭씨 37도에서 100분 동안 인큐베이션한다. 다음으로, 장착을 위해 세 마이크로리터의 장착 미디어를 슬라이드에 떨어뜨립니다.
커버 슬립에서 과도한 세척 버퍼를 탭하고 셀이 아래쪽을 향하도록 커버 슬립을 장착 매체에 놓습니다. 덮개 슬립을 제자리에 고정하기 위해 소량의 투명한 매니큐어로 측면을 밀봉하십시오. 얇게 썬 조직을 장착하려면 조직 조각을 준비된 슬라이드로 조심스럽게 옮기고 평평하게 놓습니다.
그런 다음 5 ~ 10 마이크로 리터의 장착 배지를 조직 슬라이스에 떨어 뜨립니다. 유리 커버 슬립을 티슈 슬라이스 위에 놓고 앞에서 설명한 것처럼 투명한 매니큐어로 커버 슬립을 밀봉하십시오. 공초점 현미경을 사용한 디지털 이미징의 경우 각 형광 채널의 게인, 오프셋 및 레이저 파워를 조정하여 배경 노이즈를 줄이고 형광 신호를 향상시킵니다.
형광 신호가 과포화되지 않았는지 확인하십시오. 배양 뉴런의 경우 ND 획득 탭에서 파일에 저장을 클릭합니다. 그런 다음 찾아보기에서 이미지를 저장할 파일을 선택하고 파일 이름을 입력합니다.
그런 다음 Z 탭에서 대칭 모드 범위로 정의 옵션을 선택합니다. 초점을 가장 좋은 맵 두 평면으로 설정하고 상대 버튼을 클릭하여 이 초점 평면을 Z-스택의 중간으로 설정합니다. 그런 다음 한 마이크로미터 스텝으로 범위를 다섯 마이크로미터로 설정하고 Z 이동 중에 활성 셔터 닫기를 확인합니다.
파장 탭에서 광학 구성에서 이전에 구성된 수집 설정이 있는 광학 버튼의 이름을 선택하고 지금 실행을 클릭합니다. 슬라이스된 티슈의 경우 획득 메뉴에서 큰 이미지 스캔을 선택한 다음 캡처 패널 아래에서 이전에 구성된 획득 설정이 있는 광학 버튼을 선택합니다. 또한 이 패널에서 올바른 목표를 선택합니다.
그런 다음 영역 패널과 아이피스 아래에서 화살표 키를 사용하여 관심 영역 또는 ROI의 경계를 설정합니다. 그런 다음 큰 이미지를 파일에 저장을 클릭하고 이미지의 저장 경로 파일 이름을 만듭니다. 마지막으로 설정 패널에서 다중 채널 캡처가 선택되어 있는지 확인합니다.
그런 다음 광학 구성에서 이전에 구성된 수집 설정이 있는 광학 단추의 이름을 선택합니다. ImageJ에서 이미지 메뉴로 이동하여 조정을 클릭한 다음 임계값을 클릭하여 임계값 옵션을 엽니다. 이미지에 어두운 배경이 있는 경우 어두운 배경 옵션을 선택합니다.
그런 다음 이전에 결정된 최적화된 임계값 설정당 임계값의 상한과 하한을 조정하고 적용을 클릭합니다. 배양된 세포의 경우 MAP2 채널과 자유 ROI 도구를 사용하여 수상 돌기 및 소마를 포함한 각 뉴런에 대한 ROI를 그립니다. 슬라이스된 조직의 경우 관심 영역을 캡슐화하는 슬라이스 이미지 내에 자유 손 ROI를 그립니다.
그런 다음 분석 메뉴를 열고 측정을 클릭하여 ROI 영역을 가져옵니다. 각 ROI 내에서 펀타 수를 감지하려면 입자 분석과 같은 자동 감지 도구를 사용하십시오. 분석됨 메뉴에서 분석된 입자를 선택하고 누점 크기 지름을 정의합니다.
그런 다음 표시 드롭 다운 메뉴에서 오버레이 마스크 옵션을 선택한 다음 결과 표시 옵션을 선택하고 확인을 클릭하십시오. 펀타 수를 개별 ROI의 영역으로 나누려면 스프레드시트에 팝업된 결과에서 각 이미지의 결과를 복사하여 붙여 넣습니다. 어떤 파일에서 얻은 데이터를 식별하고 샘플링하고 ROI 영역을 펀타 수로 나눕니다.
마지막으로, 대조군 샘플에 대한 결과를 정규화하기 위해, 대조군 샘플에 대한 결과를 평균화하고, 모든 샘플의 수득된 결과를 대조군의 평균으로 나눈다. GABAB 작용제인 바클로펜은 신속한 항우울제 Ro-256981의 시험관내 효능을 위해 요구된다. 시냅스 형성의 증가는 흰 펀타의 증가에 의해 입증됩니다.
바클로펜이 없으면 시냅스 형성의 증가가 보이지 않습니다. 생체내에서, 신속한 항우울제의 복강내 주사는 식염수 대조군에 비해 시냅스 형성의 증가를 초래한다. 일부 펀타는 기술 제어 이미지에 나타나지만 일반적으로 다른 패널의 큰 펀타와 비교하여 흰색 사양으로 입증 된 것과 동일한 크기가 아닙니다.
또한,이 펀타는 소마 내에서 나타나는 일부 펀타에 의해 입증 된 것과 같은 위치에 있지 않습니다. DetectSyn은 질병 상태 또는 약물 치료로 인한 시냅스의 변화를 식별 할 수 있습니다. 이 방법은 시냅스의 발달 또는 분해에 영향을 미치는 장애를 연구하는 모든 연구 분야에 대한 통찰력을 제공하는 데 도움이 될 수 있습니다.
