DetectSyn tire parti de la technologie de test de ligature de proximité pour identifier rapidement les changements dans les synapses. Nous fournissons également un protocole pour analyser les résultats. Le principal avantage de DetectSyn est la rapidité avec laquelle les résultats peuvent être obtenus dans les grandes régions de tissu qui peuvent être analysées.
Pour commencer, retirez soigneusement la solution bloquante avec une pipette Pasteur en plastique sans perturber les cellules. Ensuite, tapissez une grande boîte de Petri en plastique avec Du Parafilm. Et à l’aide de pinces, transférez soigneusement les glissières de couverture sur le Parafilm.
Ajouter 60 microlitres de la solution d’anticorps primaires au sommet du couvercle, en veillant à ce que la solution d’anticorps ne déborde pas sur les côtés du couvercle. Pour fournir de l’humidité et éviter que les échantillons ne se dessèchent pendant l’incubation, ajoutez de l’eau ultrapure à une boîte de Petri plus petite et placez soigneusement le plat autour des glissières de couverture. Ensuite, couvrez la plus grande boîte de Petri et incubez les cellules cultivées pendant une heure à température ambiante.
Après l’incubation avec l’anticorps primaire, utilisez une pince pour extraire soigneusement la solution d’anticorps primaire des feuillets de couverture sur une serviette en papier et transférez les feuillets de couverture dans leur plaque originale de 24 puits remplie de 500 microlitres de PBS. Ensuite, lavez les échantillons avec du PBS trois fois pendant 10 minutes chacun avec une légère agitation sur un agitateur orbital. Après le dernier lavage, transférer les feuillets de couverture dans la grande boîte de Petri et ajouter 40 microlitres de la solution d’anticorps secondaire au sommet du couvercle.
Couvrir la boîte de Pétri et incuber les échantillons à 37 degrés Celsius pendant une heure. Pour la ligature, tout en gardant la ligase sur un bloc froid, diluez la ligase 1 à 40 à l’aide de la crosse de ligature et ajoutez immédiatement 40 microlitres du mélange de ligase aux feuillets de couverture. Couvrir la boîte de Pétri et incuber les échantillons à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.
Pour l’amplification, diluer la polymérase 1280 sur un bloc froid à l’aide de la souche d’amplification. Ajoutez ensuite 40 microlitres du mélange d’amplification aux feuillets de couverture et incubez les échantillons pendant 100 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, pour le montage, déposez trois microlitres de support de montage sur une glissière.
Tapotez l’excès de tampon de lavage du couvercle et placez le couvercle avec des cellules orientées vers le bas dans le support de montage. Scellez les côtés avec une petite quantité de vernis à ongles transparent pour maintenir le couvercle en place. Pour le montage du tissu tranché, transférez soigneusement une tranche de tissu sur la lame préparée et posez-la à plat.
Ensuite, déposez 5 à 10 microlitres de support de montage sur la tranche de tissu. Placez un couvercle en verre sur la tranche de tissu et scellez le couvercle avec du vernis à ongles transparent, comme démontré précédemment. Pour l’imagerie numérique avec un microscope confocal, ajustez le gain, le décalage et la puissance laser pour chaque canal fluorescent afin de réduire le bruit de fond et d’améliorer le signal fluorescent.
Assurez-vous que le signal fluorescent n’est pas sursaturé. Pour les neurones de culture, sous l’onglet Acquisition ND, cliquez sur Enregistrer dans le fichier. Ensuite, sous Parcourir, choisissez un fichier pour enregistrer l’image et entrez le nom du fichier.
Ensuite, sous l’onglet Z, sélectionnez l’option Mode symétrique défini par plage. Réglez le focus sur la meilleure carte à deux plans et cliquez sur le bouton Relatif pour définir ce plan focal comme le milieu de la pile z. Ensuite, réglez la plage à cinq micromètres avec un micromètre et cochez Fermer l’obturateur actif pendant le mouvement Z.
Sous l’onglet Longueur d’onde, sélectionnez le nom du bouton optique avec les paramètres d’acquisition précédemment configurés sous Configuration optique et cliquez sur Exécuter maintenant. Pour les tissus découpés, dans le menu Acquérir, choisissez Numériser une grande image, puis sous le panneau de capture, sélectionnez le bouton optique avec les paramètres d’acquisition précédemment configurés. Sélectionnez également l’objectif correct dans ce panneau.
Ensuite, sous le panneau de zone et l’oculaire, utilisez les touches fléchées pour définir les limites de la région d’intérêt ou du retour sur investissement. Cliquez ensuite sur Enregistrer une grande image dans un fichier et créez un nom de fichier de chemin d’enregistrement pour l’image. Enfin, sous le panneau de configuration, assurez-vous que Multichannel Capture est coché.
Choisissez ensuite le nom du bouton optique avec les paramètres d’acquisition précédemment configurés sous Configuration optique. Dans ImageJ, ouvrez l’option de seuil en accédant au menu de l’image, en cliquant sur Ajuster, puis sur Seuil. Choisissez l’option Arrière-plan sombre si l’image a un arrière-plan sombre.
Ensuite, ajustez les limites supérieure et inférieure du seuil selon les paramètres de seuil optimisés précédemment déterminés et cliquez sur Appliquer. Pour les cellules cultivées, utilisez le canal MAP2 et un outil de retour sur investissement à main levée pour dessiner un retour sur investissement pour chaque neurone, y compris les dendrites et le soma. Pour les tissus découpés, dessinez un retour sur investissement à main levée dans l’image de la tranche qui encapsule la zone d’intérêt.
Obtenez ensuite la zone du ROI en ouvrant le menu Analyser et en cliquant sur Mesurer. Pour détecter le nombre de punta dans chaque ROI, utilisez un outil de détection automatique comme l’analyse des particules. Dans le menu Analysé, sélectionnez Particules analysées et définissez le diamètre de la taille du puncta.
Ensuite, dans le menu déroulant Afficher, choisissez l’option Masques de superposition, puis cochez l’option Afficher les résultats et cliquez sur OK. Pour diviser le nombre de punta par la zone du retour sur investissement individuel, copiez et collez les résultats de chaque image à partir de la fenêtre contextuelle des résultats dans une feuille de calcul. Identifiez le fichier et échantillonnez les données à partir desquelles nous sommes obtenus, et divisez la zone du retour sur investissement par le nombre de punta.
Enfin, normaliser les résultats pour contrôler les échantillons, faire la moyenne des résultats pour les échantillons témoins et diviser les résultats obtenus de tous les échantillons par la moyenne du témoin. L’agoniste du GABAB, le baclofène, est nécessaire pour l’efficacité in vitro de l’antidépresseur rapide Ro-256981. Une augmentation de la formation de synapses est démontrée par une augmentation de la punta blanche.
Sans baclofène, aucune augmentation de la formation de synapses n’est observée. In vivo, l’injection intrapéritonéale de l’antidépresseur rapide entraîne une augmentation de la formation de synapses par rapport au contrôle salin. Bien que certaines punta apparaissent dans les images de contrôle technique, elles ne sont généralement pas de la même taille que celle démontrée par la spécification blanche par rapport à la grande punta dans les autres panneaux.
De plus, ces punta ne sont pas au même endroit comme le démontre certaines punta apparaissant dans le soma. DetectSyn peut identifier les changements dans les synapses dus à un état pathologique ou à un traitement médicamenteux. Cette méthode peut aider à donner un aperçu de tout domaine de recherche qui étudie les troubles affectant le développement ou la dégradation des synapses.
