使用实时细胞代谢通量分析仪监测成骨细胞生物能量学

这种方法可用于确定细胞能量学，如ATP产生速率，以及实时确定细胞对特定代谢物的偏好。首先，加入200微升XF校准剂，并在测定前将实用板孵育至少一小时。使用补充的XF DMEM制备80毫升XF测定培养基。

在冰上解冻寡霉素A，鱼藤酮和抗霉素A。上下移液化合物以在使用前溶解它们。向每个试管中加入三毫升制备的测定培养基，标记A和B.将26.4微升2.5毫摩尔寡霉素A加入管A和3.1微升12.67毫摩尔鱼藤酮，4.1微升9.4毫摩尔抗霉素A和30微升Hook污渍到管B中，在相应的注射口中加载10倍浓度的这些抑制剂。

最后，20微升这些化合物将在200微升的测定培养基中加载到细胞中。从37摄氏度培养箱中取出细胞培养微孔板，并在显微镜下观察细胞。从水浴中取出测定培养基。

用200微升预热的测定培养基轻轻洗涤细胞两次，每孔加入200微升测定培养基。在显微镜下检查细胞，以确保细胞保持粘附在孔上。确保D5和E8孔中的细胞粘附在一致的单层上，并且在洗涤步骤中没有被冲走。

细胞成像软件使用这两个孔来设置自动对焦和自动曝光。在设备旁边的计算机中打开桌面软件。检查控制器软件左下角的连接状态。

转到模板并选择XF ATP速率测定模板或适当的测定模板。选择屏幕顶部的组定义并定义组。选择板图布局并根据定义的组分配孔。

验证仪器协议。确保添加的化合物正确列出，并包括项目信息以供将来参考。单击运行分析。

这将提示选择结果文件存储位置。选择保存结果文件的位置。保存带有检测日期的文件，然后单击开始运行。

将传感器盒和实用程序板放在托盘上，然后单击"我已准备好"以启动校准。在计算机上打开细胞成像软件。确保微孔板成像仪已打开，并且端口已连接到计算机。

检查屏幕左下角的状态栏，确保温度设置为 37 摄氏度，并且连接状态应以绿色突出显示为就绪。扫描板条形码以启动成像过程。为细胞板提供一个名称，然后点击保存。

明场和荧光图像将保存在此处。单击"执行明场扫描"，在下一个屏幕中，"板"和"扫描"菜单将显示成像选项。在检测之前，选择开始明场扫描。

将细胞培养微孔板和板盖放在托盘支架上，并将A1孔与A1标记对齐。单击关闭托盘。明场图像采集出现在下一个带有板块图的屏幕中。

单击"扫描所有孔"并扫描30至35分钟。校准完成后，软件将显示"称重传感器板"对话框。然后，单击"打开托盘"以用细胞培养微孔板替换实用程序托盘。

请注意，细胞培养板位于微孔板成像仪中。扫描后，取出细胞培养微孔板并将其置于分析仪中以进行测定。然后，单击称重传感器板以启动测定。

等到测定开始并显示估计的完成时间。分析完成后，软件将显示"卸载传感器盒"和"细胞板"对话框。单击"弹出"并从分析仪中取出细胞培养微孔板。

小心地卸下传感器盒并盖上电池板盖。将出现"检测完成"对话框。然后，单击"查看结果"以打开测定结果文件或对数据进行归一化。

测定完成后，用手持式条形码阅读器扫描板条形码。如果板材已经过成像，则不需要新名称。选择荧光和细胞计数。

将细胞板放在托盘支架上，然后单击关闭托盘。在图像采集窗口中，选择扫描所有孔以开始成像。通过随机单击几个孔来查看成像和细胞成像应用程序中的荧光图像和细胞计数。

荧光成像完成后，导出图像以供参考。成像和细胞计数完成后，打开结果文件，然后单击"归一化"。单击"导入"，然后选择"应用"，以便使用细胞计数自动对测定进行归一化。

寡霉素A和FCCP应激源混合注射增加了对照组的基线活性。应激源在对照组和治疗组显示出显着高的能量水平。另一方面，治疗二具有相对较低的基线活性，并且细胞变得更加有氧。

该图表明对照和实验细胞都使用糖酵解和线粒体氧化磷酸化来产生ATP。实验组显示通过糖酵解减少ATP生成，线粒体呼吸增加。治疗组基础呼吸率相对低于对照组。

两组的呼吸和ATP产生率均降低，伴随着质子泄漏，随后注射寡霉素A。注射FCCP后，细胞的呼吸速率再次上升到其最大呼吸。最后注射鱼藤酮和抗霉素A再次降低OCR。

第三次注射后，鱼藤酮和抗霉素A联合关闭线粒体呼吸，与对照组相比，治疗组的基础和最大呼吸相对没有变化。该图显示，对照组高度依赖葡萄糖途径，而谷氨酰胺氧化在对照组中是有效的。脂肪酸途径表明，治疗增加了细胞的整体容量。

酸板上多个注射端口的可用性有助于我们确定多种药物在单个时间点对细胞能量的影响。