自发荧光成像评估细胞代谢

ADH和FAD是内源性分子，在不同的激发和发射波长下表现出自发荧光。由于它们被用作代谢反应的辅酶，自发荧光显微镜可以评估细胞代谢。NADH和FAD的自发荧光成像不需要外源性标记，是一种具有亚细胞分辨率的非破坏性方法。

自发荧光显微镜可用于活体样品和时间过程研究。自发荧光成像可以广泛应用于任何活细胞或组织。自发荧光成像已用于神经元，癌细胞，肿瘤，体内，干细胞和免疫细胞。

演示该程序的将是德克萨斯A&M大学定量光学成像实验室的研究生Linghao Hu。通过打开多光子荧光寿命显微镜的所有组件（包括激光源和探测器）开始实验。在放置样品之前，打开亮场灯并确保光线进入目镜。

然后，为细胞成像选择一个物镜。如果不使用空气物镜，请在物镜顶部涂抹一滴适当的浸入介质。将玻璃底培养皿放在显微镜载物台上的样品架上。

然后，使用X / Y载物台控制将标本与物镜居中，确保标本固定，并且在成像过程中不会移动。完成后，观察目镜并将物镜向上移动以聚焦在细胞上。如果显微镜在外壳内，请关闭灯箱门。

接下来，打开图像采集软件，单击"多光子成像"选项卡以设置手稿中描述的多光子成像参数。将检测器的增益调整为荧光寿命成像或FILM的最佳值。然后，将样品每个像素处激光消耗的停留时间更改为所需值。

对于烟酰胺腺嘌呤磷酸二核苷酸或NADPH，将多光子激光器设置为750纳米。然后，确认激光器的功率控制设置为零，以便在打开激光器上的快门时电池不会损坏。将发射过滤器设置为400至500纳米。

设置参数后，开始以对焦或实时取景方式成像，以优化图像设置。慢慢地将激光功率从三毫瓦增加到八毫瓦，同时确保电池处于焦点状态。调整后，记录使用的最大功率。

使用记录的最大功率设置在培养皿的其他部分上进行成像。收集图像积分时间为60秒的NADPH-FILM图像，并检查图像是否具有足够数量的光子，例如荧光寿命衰减曲线内细胞质像素的峰值为100光子。如果光子数量太少，请增加激光功率或图像采集的持续时间。

对于黄素腺嘌呤二核苷酸或FAD成像，将多光子激光器设置为890纳米，并等待激光器在新波长处锁定模式。确保激光器的功率控制最初设置为零。将发射过滤器设置为500至600纳米。

要优化图像设置，请通过将激光功率增加到5至10毫瓦并记录使用的最大功率，以对焦或实时取景方式开始成像。对后续视场的 FAD 成像使用相同的功率设置。收集图像积分时间为60秒的FAD-FILM图像，并检查图像在荧光寿命衰减曲线内是否有足够的光子。

如果光子数量太少，请增加激光功率或图像采集的持续时间，并重复成像以获得额外的四到五个视场或FOV，每个图像间隔在两个FOV上。为了制造80毫摩尔氰化钠溶液，将130.24毫克氰化钠溶解在25毫升PBS中。从培养皿中，吸取100微升培养基，用100微升氰化钠溶液代替，在培养皿中获得4毫摩尔浓度的氰化物。

将细胞置于培养箱中五分钟，以使细胞与氰化物溶液反应。氰化物暴露后，获取细胞的NADPH和FAD图像，如前所述。该研究使用来自尿素的测量仪器响应函数（IRF）计算了荧光寿命参数。

参数在用于分割的每个细胞的细胞质的像素上取平均值。识别并屏蔽单个细胞以消除背景噪音。然后，鉴定细胞核并将其投射到细胞掩膜上。

此外，过滤细胞以去除不适合典型细胞大小的被遮蔽区域。NADPH和FAD的多光子荧光寿命成像允许在氰化物处理之前和之后可视化细胞形态和代谢。观察到，氰化物处理后NADPH寿命降低，而氰化物处理后FAD寿命增加。

具有代表性的箱形图表明，氰化物处理后MCF7细胞的光学氧化还原比降低。氰化物暴露降低了MCF7细胞的振幅加权NADPH寿命。NADPH的短寿命和长寿命减少，但NADPH alpha的寿命增加。

对于FAD，MCF7细胞的振幅加权寿命在氰化物暴露后增加。FAD的短寿命和长寿命都增加了，但FAD alpha的寿命减少了。重要的是要有足够的激光功率进入样品，但请记住，太多的功率会对细胞造成损害。

由于自发荧光成像不会对细胞造成损害，因此可以对相同的样品进行后续生化测定。