Este método é útil para determinar a energia celular, como a taxa de produção atp, e também para determinar a preferência celular em direção a um metabólito específico em tempo real. Para começar, adicione 200 microliters de calibrante XF e incubar a placa de utilidade por pelo menos uma hora antes do ensaio. Prepare 80 mililitros de mídia de ensaio XF usando DMEM XF suplementado.
Descongele oligomicina A, rotenona e antimicina A no gelo. Pipeta os compostos para cima e para baixo para solubilizá-los antes de usá-los. Adicione três mililitros de ensaio preparado médio a cada tubo, rotulados A e B.Add 26.4 microliters de 2,5 milimolar oligomicina A no tubo A e 3,1 microlitres de 12,67 mililitros rotenona, 4.1 microliters de 9,4 milimônios antimicina A, e 30 microliter a mancha de Gancho no tubo B.Carregue uma concentração de 10x desses inibidores na porta de injeção correspondente.
E, finalmente, 20 microliters desses compostos serão carregados nas células em 200 microliters de mídia de ensaio. Remova a microplaca da cultura celular da incubadora de 37 graus Celsius e observe as células sob o microscópio. Remova o meio de ensaio do banho de água.
Lave suavemente as células com 200 microliters de médio ensaio pré-aquecido duas vezes, e adicione 200 microliters de mídia de ensaio por poço. Verifique as células sob o microscópio para garantir que as células permaneçam aderidas aos poços. Certifique-se de que as células dos poços D5 e E8 sejam aderidas a uma monocamada consistente e não foram lavadas durante a etapa de lavagem.
O software de imagem celular usa esses dois poços para definir o foco automático e a exposição automática. Abra o software de desktop no computador ao lado do equipamento. Verifique o status da conexão no canto inferior esquerdo do software do controlador.
Vá para Modelos e selecione o modelo de ensaio de taxa ATP XF ou o modelo de ensaio apropriado. Selecione Definições de grupo na parte superior da tela e defina os grupos. selecione o layout do mapa da placa e atribua os poços dependendo dos grupos definidos.
Verifique o protocolo de instrumentos. Certifique-se de que os compostos adicionados estejam corretamente listados e inclua as informações do projeto para referências futuras. Clique em Executar ensaio.
Isso solicitará a seleção do local de armazenamento do arquivo de resultado. Selecione o local para salvar o arquivo de resultado. Salve o arquivo com a data do ensaio e clique em Iniciar Execução.
Coloque o cartucho do sensor e a placa de utilidade na bandeja e clique em Estou pronto para iniciar a calibração. Abra o software de imagem celular no computador. Certifique-se de que o imager de microplacar está ligado e as portas estão conectadas ao computador.
Verifique a barra de status no canto inferior esquerdo da tela para garantir que a temperatura esteja definida para 37 graus Celsius e que o status da conexão deve ser destacado em verde como pronto. Escaneie o código de barras da placa para iniciar o processo de imagem. Forneça um nome para a placa de celular e aperte Salvar.
Imagens brilhantes e fluorescentes serão salvas aqui. Clique em Executar Brightfield Scan e, na próxima tela, Menu de placa e varredura mostrar as opções de imagem. Antes do ensaio, selecione Iniciar varredura brightfield.
Coloque a microplacão de cultura celular e a tampa da placa no porta-bandeja e alinhe bem A1 com a marca A1. Clique em Close Tray. A aquisição de imagens Brightfield aparece na próxima tela com um mapa de placas.
Clique em Digitalizar Todos os Poços e escaneie por 30 a 35 minutos. Após a conclusão da calibração, o software exibe a caixa de diálogo Load Cell Plate. Em seguida, clique em Abrir bandeja para substituir a bandeja de utilidade por uma microplaca de cultura celular.
Note que a placa de cultura celular está no imager de microplacão. Após a varredura, remova a microplacão de cultura celular e coloque-a no analisador para realizar o ensaio. Em seguida, clique em Carregar a placa celular para iniciar o ensaio.
Aguarde até que o ensaio comece e exiba o tempo estimado de conclusão. Após a conclusão do ensaio, o software exibe o cartucho do sensor de descarga e a caixa de diálogo Cell Plate. Clique em Ejetar e remova a microplaca de cultura celular do analisador.
Remova cuidadosamente o cartucho do sensor e substitua a tampa da placa da célula. A caixa de diálogo Assay Complete aparece. Em seguida, clique em Exibir resultados para abrir o arquivo de resultado do ensaio ou para normalizar os dados.
Após a conclusão do ensaio, escaneie o código de barras da placa com o leitor de código de barras portátil. Se a placa já foi imageda, não exigirá um novo nome. Selecione Fluorescência e Contagem de células.
Coloque a placa de célula no suporte da bandeja e clique em Close Tray. Na janela de aquisição de imagens, selecione Digitalizar Todos os Poços para iniciar a imagem. Revise as imagens fluorescentes e a contagem de células no aplicativo de imagem e imagem celular clicando aleatoriamente em alguns dos poços.
Uma vez que a imagem de fluorescência esteja completa, exporte as imagens para referências adicionais. Uma vez que a contagem de imagens e células esteja completa, abra o arquivo de resultados e clique em Normalizar. Clique em Importar e selecione Solicitar o software de desktop para normalizar o ensaio com contagem de células automaticamente.
A injeção de mistura de estressador de oligomicina A e FCCP aumentou a atividade de linha de base do grupo controle. Os estressores apresentaram um nível de energia significativamente elevado no controle e tratamento de um grupo. Por outro lado, o tratamento dois teve uma atividade de linha de base relativamente menor, e as células tornaram-se mais aeróbicas.
A figura indica que tanto o controle quanto as células experimentais utilizam glicólise e fosforilação oxidativa mitocondrial para geração ATP. O grupo experimental apresenta uma redução na geração de ATP via glicolise e um aumento na respiração mitocondrial. A taxa de respiração basal no grupo de tratamento é relativamente menor do que o grupo controle.
As taxas de respiração e de produção de ATP em ambos os grupos são diminuídas, juntamente com o vazamento de prótons seguido de uma injeção de oligomicina A. As taxas de respiração das células voltam à sua respiração máxima após a injeção de FCCP. A injeção final de rotenona e antimicina A diminui novamente o OCR.
Após a terceira injeção, a respiração mitocondrial é desligada pela combinação de rotenona e antimicina A.Em comparação com o grupo controle, a respiração basal e máxima dos grupos de tratamento não tem relativamente nenhuma alteração. O número mostra que o grupo controle é altamente dependente da via de glicose, enquanto a oxidação da glutamina foi eficiente no grupo controle. A via do ácido graxo mostra que o tratamento aumentou a capacidade geral das células.
A disponibilidade de múltiplas portas de injeção na placa ácida nos ajuda a determinar o efeito de múltiplas drogas na energia celular em um único ponto de tempo.
