小鼠输卵管的显微解剖和解离：个体片段鉴定和单细胞分离

不同的输卵管节段具有不同的生理功能，并且对病理变化具有不同的易感性。在非常小的小鼠输卵管中鉴定不同的片段具有挑战性，通过组织解离产生良好分化的细胞的良好产量也是如此。在本视频中，我们将演示如何解开小鼠输卵管的线圈，识别不同的片段以便可以单独分析它们，最后，如何产生相对高产量的分化解离细胞。

更好地了解壶腹特有的环境可以改善体外受精技术。此外，通过将内底与其他部分进行比较，我们可以更好地了解内底的恶性转化倾向。单细胞解离程序从输卵管中释放基质细胞以及上皮细胞。

我们的方法还提供了单独分析免疫，平滑肌和上皮细胞对输卵管生理学和病理学的贡献的机会。起初，在解剖显微镜下工作可能很困难。我建议使用更大的管子（如子宫）进行练习，以确保您的工具足以进行输卵管显微切除术。

首先将一块牙蜡贴在带有粘合剂的培养皿上，然后让它变干。然后用70%乙醇消毒盘子。表面现在已准备好进行解剖。

准备解剖时，在解剖显微镜下将含有牙蜡的培养皿固定在冷平台上。用70%乙醇消毒动物的腹侧表面。然后用无菌解剖剪刀打开腹腔和盆腔。

将胃肠道移动到一侧以定位背侧双角子宫。沿着每个子宫角向喙方向移动，以定位包裹在肾脏正下方的子宫脂肪垫中的每个输卵管和卵巢。然后用卵巢切除两个侧输卵管和仍然用解剖剪刀连接的远端子宫角的一部分。

切开每个子宫外侧角，大约一到两厘米的角仍然附着在盘绕的输卵管和卵巢上。立即将组织浸没在两毫升冷解剖介质中，然后用无菌的25号针将子宫组织贴在牙蜡上，以确保组织进行解剖。清洁并解剖卵巢脂肪垫和结缔组织，以清晰地观察输卵管。

使用一毫升注射器分配一到两滴无菌的1%甲苯胺蓝色染料溶液，并孵育30秒至一分钟。用冷DPBS冲洗，然后除去所有液体。轻轻地将卵巢从盘绕的输卵管中拉出。

在宽韧带的滑囊膜处切开，以从输卵管中取出卵巢，而不会影响输卵管组织。定位输卵管的远端腓肠末端，该端位于子宫输卵管连接处的侧侧。轻轻拉动管子，用弹簧形微剪刀切开中胚层，以解开输卵管。

切开管子以产生心底区域。然后通过在第二圈和第三圈之间切割来切除壶腹区域。最后，将剩余部分切到子宫输卵管连接处，这是峡部区域。

立即在液氮中快速冷冻解剖的组织片段，然后向组织中加入200微升冷RNA提取试剂和一对一的均质微球混合物进行RNA分离。从腓骨区域开始，用弹簧剪刀纵向切开管子，并使用镊子作为杠杆来暴露腔内上皮。将切开的部分和剩余的输卵管切成大约一到两毫米的段。

然后向组织中加入5毫升温热的非酶解解缓冲液，并在37摄氏度下孵育。此处显示了闭塞素、细胞核和乙酰化微管蛋白阳性细胞簇的荧光和相差图像。红色表示闭塞素，蓝色表示细胞核，绿色表示乙酰化微管蛋白。

纤毛顶端边界在整个方案中保持完整，并承受对单个细胞的进一步消化。在这些具有代表性的图像中，显示了合并的红色、蓝色、相衬和绿色通道。经过短暂的蛋白酶孵育后，大多数细胞是单一的。

碘化丙啶染色在明场、红色通道 PI 阳性和合并中显示出约 93% 的活力。合并时的插图显示单个解离单元格上的完整纤毛边框。这样的细胞具有活跃的跳动纤毛。

通过微量分光光度计和生物分析仪评估整个RNA的产量和质量。结果表明，该方法每段产生800至1， 200纳克RNA，但输液管样品除外，其中可能需要从两只动物中汇集以获得下游测定的适当产量。所呈现的内脑袋结果来自两只动物，共四个腹足区。

该协议成功地实现了使用微量分光光度计和生物分析仪分析的纯RNA。样品的吸收比为260 x 280，介于1.8和2之间，是纯RNA核苷酸物种的典型特征。生物分析样品显示出高RNA完整性，评估的RNA完整性值高于7，适合下游表达和测序分析。

请记住保留一到两厘米的子宫角，以将输卵管系统固定在解剖平台上。此外，使用甲苯胺蓝色染料有助于输卵管的快速开卷。开卷速度越快，保存效果越好，RNA降解量越少。

该方法足以获得适当质量的RNA，用于允许单个片段测序的RNA测序。细胞解离适用于单细胞测序或流式细胞术，允许更精确的片段和细胞分析。该方法将有助于将视野从全管分析中移开，从而掩盖片段或单细胞水平的差异。