מקטעי oviduct שונים יש פונקציות פיזיולוגיות ברורות והם רגישים באופן דיפרנציאלי לשינוי פתולוגי. זיהוי של המקטעים השונים בעכבר קטן מאוד oviduct הוא מאתגר, כמו גם הייצור של תשואה טובה של תאים מובחנים היטב על ידי ניתוק רקמות. בסרטון זה, נדגים כיצד לשחרר את oviduct העכבר, לזהות את המקטעים השונים, כך שהם יכולים להיות מנותחים בנפרד, ולבסוף, כיצד לייצר תשואה גבוהה יחסית של תאים מנותקים מובחנים.
הבנה טובה יותר של הסביבה הספציפית לאמפולה עשויה לשפר את טכניקות ההפריה חוץ גופית. כמו כן, על ידי ניגוד התבערה עם קטעים אחרים, אנו עשויים להבין טוב יותר את הנטייה של infundibulum לשינוי ממאיר. הליך פירוק התא הבודד משחרר סטרומלי, כמו גם תאי אפיתל מן oviduct.
השיטה שלנו מספקת גם הזדמנויות לנתח בנפרד את תרומות מערכת החיסון, השריר החלקה ותאי האפיתל לפיזיולוגיה ולפתולוגיה של האובידוקט. עבודה תחת מיקרוסקופ ניתוח יכולה להיות קשה בהתחלה. הייתי ממליץ להתאמן עם צינור גדול יותר כגון הרחם כדי להבטיח כי הכלים שלך מתאימים עבור microdissection oviduct.
התחל על ידי הדבקת חתיכת שעווה דנטלית לצלחת פטרי עם דבק ולתת לו להתייבש. ואז לחטא את המנה עם 70% אתנול. פני השטח מוכנים כעת לחיתוך.
לשתק את צלחת פטרי המכילה את שעוות השיניים על הפלטפורמה הקרה תחת מיקרוסקופ ניתוח כאשר מוכן לחיתוך. לחטא את פני השטח הגחוניים של החיה עם 70% אתנול. ואז לפתוח את חלל הבטן והאגן עם מספריים ניתוח סטריליים.
העבר את מערכת העיכול לצד אחד כדי לאתר את הרחם הדו-קרן הגבי. בצע כל קרן הרחם rostrally כדי לאתר כל oviduct ושחלה כי הם עטופים כרית השומן ברחם ממש מתחת לכליה. לאחר מכן לחתוך הן oviducts לרוחב עם השחלות וחלק של קרן הרחם דיסטלי עדיין מחובר באמצעות מספריים ביתור.
חותכים כל קרן רחם לרוחב עם כ 1 עד 2 ס"מ של הקרן עדיין מחובר oviduct מפותל השחלה. להטביע את הרקמה מיד בשני מיליליטרים של מדיום ביתור קר, ולאחר מכן להצמיד את רקמת הרחם שעווה שיניים עם מחט 25 מד סטרילי כדי לאבטח את הרקמה לנתיחה. לנקות ולנתח את כרית השומן השחלות ורקמת החיבור כדי לדמיין את oviduct בבירור.
השתמש מזרק מיליליטר אחד כדי לחלק 1 עד 2 טיפות של סטרילי 1% טולואידין פתרון צבע כחול ודגור במשך 30 שניות עד דקה אחת. יש לשטוף עם DPBS קר ולאחר מכן להסיר את כל הנוזלים. משוך קלות את השחלה מן oviduct מפותל.
חותכים את קרום הבורסל ברצועה הרחבה כדי להסיר את השחלה מן oviduct מבלי להתפשר על רקמת החצוצרות. אתר את הקצה הפימברי הדיסטלי של האובידוקט שנמצא לרוחב לצומת חצוצרות הרחם. משכו בעדינות את הצינור וחתכו את המזוסלפינקס עם מיקרו-מספריים קפיציים כדי לשחרר את האובידוקט.
חותכים את הצינור כדי לייצר את האזור הפנימי. לאחר מכן לחתוך את אזור האמפולר על ידי חיתוך בין הסיבובים 2 ו -3. לבסוף, לחתוך את החלק הנותר לצומת חצוצרות הרחם שהוא האזור האיסתמי.
מיד להקפיא את מקטעי הרקמה המנותחים בחנקן נוזלי ולאחר מכן להוסיף 200 מיקרוליטרים של ריאגנט מיצוי RNA קר תערובת חרוזי הומוגניזציה אחד על אחד לרקמה לבידוד RNA. החל באזור הפימבריאלי, לחתוך את הצינור אורך עם מספריים springform ולהשתמש מלקחיים כמנוף לחשוף את האפיתל הזוהר. טחון את החלקים הפתוחים החתוכים ואת oviduct הנותרים לתוך קטעים כ 1 עד 2 מילימטר.
לאחר מכן מוסיפים חמישה מיליליטר של חוצץ דיסוציאציה לא אנזימטית חם לרקמה ודגורים ב 37 מעלות צלזיוס. תמונות פלואורסצנטיות וניגודיות פאזה של צביר תאים חיוביים עבור אוקולדין, גרעינים, טובולין אצטילציה מוצגים כאן. אדום מציין occludin, כחול מציין גרעינים, וירוק מציין טובולין אצטילציה.
הגבול האפילי הסגור נשאר שלם לאורך הפרוטוקול ועומד בפני עיכול נוסף לתאים בודדים. בתמונות מייצגות אלה מוצגים ערוצים ממוזגים, אדומים, כחולים, ניגודיות פאזה וירוקים. לאחר דגירה קצרה של פרונאז, רוב התאים הם בודדים.
כתמי יודיד פרופידיום מראה כ 93% הכדאיות בברייטפילד, PI ערוץ אדום חיובי, ומיזוג. Inset בעת המיזוג מציג גבול שלם שלם בתא מנותק יחיד. תאים כאלה מכים באופן פעיל cilia.
RNA שלם הוערך לתפוקה ואיכות על ידי ספקטרופוטומטר microvolume וביואנלייזר. התוצאות מראות כי שיטה זו מניבה 800 עד 1, 200 ננוגרם RNA לכל קטע למעט דגימות לא ממונפות שבהן איגום משני בעלי חיים עשוי להיות נחוץ לתשואה מתאימה לבדיקות במורד הזרם. התוצאות המוצגות עבור אינפונדיבולום משולבות משני בעלי חיים, בסך הכל ארבעה אזורים לא ממונפים.
פרוטוקול זה משיג בהצלחה RNA טהור מנותח עם ספקטרופוטומטר מיקרו-וולום וביואנלייזר. לדגימות יש יחס ספיגה של 260 על 280 ננומטר בין 1.8 ל -2, אופייני למינים נוקלאוטידים RNA טהורים. ניתוח ביולוגי של הדגימות הראה שלמות RNA גבוהה עם מספר שלמות RNA מוערך מעל שבע, מתאים לביטוי במורד הזרם וניתוח רצף.
זכור לשמור על סנטימטר אחד עד שני סנטימטרים של קרן הרחם כדי להצמיד את מערכת החצוצרות לפלטפורמת החיתוך. בנוסף, השימוש בצבע הכחול טולואידין מסייע בהתנתקות מהירה של oviduct. ככל שההתפרקות מהירה יותר, כך השימור טוב יותר והכמות הקטנה ביותר של השפלת RNA.
שיטה זו מספיקה כדי לקבל RNA באיכות מתאימה עבור ריצוף RNA המאפשר ריצוף מקטע בודד. ניתוק התא מתאים לרצף תא בודד או לציטומטריית זרימה המאפשרת ניתוח מקטע ותא מדויק יותר. השיטה תסייע להזיז את השדה מעבר לניתוח שפופרת שלם שמסווה הבדלים ברמת המקטע או התא הבודד.
